丁香假單胞菌黃瓜致病變種（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）引起的黃瓜細(xì)菌性角斑病在世界范圍內(nèi)皆有發(fā)生,造成不同程度的損失,同時(shí)也引起甜瓜細(xì)菌性葉斑病,是一種種傳病害。近年來在中國逐漸發(fā)展嚴(yán)重,危害嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成嚴(yán)重減產(chǎn)。所以建立高效,快捷,操作簡單的檢測(cè)技術(shù)是防止此病原菌傳播的有效手段。瓜類細(xì)菌性果斑�。╞acterial fruit blotch）的病原菌為西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）,是一種危害西瓜和甜瓜的世界檢疫性種傳病害。丁香假單胞黃瓜致病變種和西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）和在甜瓜上的發(fā)病癥狀很相似,我們很難用肉眼和傳統(tǒng)的檢驗(yàn)檢疫方法將兩者區(qū)分。本研究運(yùn)用Padlock探針和LAMP兩種檢測(cè)方法,設(shè)計(jì)了針對(duì)丁香假單胞菌黃瓜致病變種甜瓜株系的特異性探針和LAMP,針對(duì)黃瓜株系的特異性探針和LAMP。同時(shí)進(jìn)行了特異性驗(yàn)證,靈敏度驗(yàn)證,模擬種子帶菌檢測(cè)和實(shí)際樣品檢測(cè)。并將探針與Macroarray技術(shù)結(jié)合進(jìn)行了病原菌的高通量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：這2條探針和2套LAMP均能把所有的參試菌株的這兩個(gè)株系... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１下香假單胞黃瓜致病變種為害黃瓜和甜瓜圖（張吉光等，２０１０）??Ｆｉｇ．?１．?Ｃｕｃｕｍｂｅｒ?ａｎｄ?ｍｅｌｏｎ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?從如所０口幻５?巧ｒ／巧各口ｅ?Ｐ乂?／幻幻７ＴＳ??

巧光定量ＰＣＲ擁有ＴａｑＭａｎ探針檢測(cè)和ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ檢測(cè)兩種檢測(cè)模式。有５＇—３’外切核酸酶活性的Ｔａｑ酶是ＴａｑＭａｎ探針的擴(kuò)增原理，并將巧光標(biāo)記加入反應(yīng)體系中。常規(guī)ＴａｑＭａｎ探針在ＰＣＲ過程中不能被延伸，５＇端發(fā)射基光發(fā)射被３＇端巧滅基團(tuán)抑制。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ?Ｉ染料特異性很強(qiáng)只與雙鏈ＤＮＡ小，發(fā)出芙光。當(dāng)它從雙鏈上釋放出來時(shí)，巧光信號(hào)減弱，所Ｗ雙鏈ＤＮＡ分子能通過巧光信號(hào)的強(qiáng)弱來進(jìn)行判斷。這項(xiàng)技術(shù)也存在一定的缺點(diǎn)，它能與非恃雙鏈ＤＮＡ結(jié)合造成假陽性結(jié)果（歐陽松應(yīng)等，２００４）??．７?Ｐａｄｌｏｃｋ?探針??Ｐａｄｌｏｃｋ探針是一條長的寡聚核昔酸鏈，長度為ｌ（Ｍ３ｂｐ左右，探針兩端（憐酸化和経基化的３端）能與目的片段進(jìn)行特異性的結(jié)合。探針兩端稱為Ｔ１端和Ｔ２端，兩端有很強(qiáng)的特異性，只有與目標(biāo)片段完全匹配時(shí)，其在連接酶的作用下，探與祀標(biāo)片段互補(bǔ)形成環(huán)狀。為了使這項(xiàng)技術(shù)用于病原菌的診斷，Ｍａｒｉａｎｎａ?Ｓｚｅ人對(duì)如何保證高特異性和在實(shí)際檢測(cè)中沒有目的祀標(biāo)的情況下如何消除自身應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化。將Ｔ１端和Ｔ２端設(shè)計(jì)成不對(duì)稱的兩端，并且Ｔ２端（３端）明思短（５端）（Ｍａｒｉａｎｎａ?Ｓｚｅｍｅｓ等?２００５）。??Ｐａｄｌｏｃｋ?ｐｒｏｂｅ??

圖３?ＬＡＭ巧Ｉ物合成圖（Ｊｕｎ化２００９）??Ｆｉｇ３．?Ｐｒｉｍｅｒ?ｆｏｒ?ＬＡＭＰ??ＡＭＰ的反應(yīng)機(jī)制可Ｗ分為Ｈ個(gè)部分。初始階段為合成啞鈴形結(jié)構(gòu)階段、循環(huán)Ｗ及再循環(huán)階段，最后會(huì)產(chǎn)生大小不一的花挪菜狀莖－環(huán)ＤＮＡ。ＬＡＭＰ采用的換活性，引物由兩個(gè)內(nèi)引物（ＦＩＰ，ＢＩＰ）及兩個(gè)外引物（Ｆ３，?Ｂ３）構(gòu)成，其視標(biāo)ＤＮＡ上的６個(gè)特異性位點(diǎn)。只有當(dāng)餓標(biāo)上這６個(gè)特異位點(diǎn)彼四條引物完全，才能進(jìn)行擴(kuò)增（Ｙａｓｕｙｏｓｈｉ?Ｍｏｒｉ，?２００９）。??作為一種新型的高特異性和快速的檢測(cè)方法，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（ｌａｍｐ）已經(jīng)用于各種領(lǐng)域。在最初的發(fā)展階段，ＬＡＭＰ運(yùn)用于檢測(cè)食品上的一些病原菌，??沙口氏菌，李斯特菌，志賀菌屬，大腸桿菌，彎曲桿菌的ｌａｍｐ試劑盒已經(jīng)商ＡＭＰ也被廣泛運(yùn)用于動(dòng)物疫病檢測(cè)中。Ｉｗａｍｏｔｏ創(chuàng)建了分支桿菌屬的檢測(cè)體系，海創(chuàng)建了日蹄疫病毒的ＲＴ－ＬＡＭＰ檢測(cè)方法，Ｚｈａｎｇ等同樣運(yùn)用ＲＴ－ＬＡＭＰ方法豬癌病毒的檢測(cè)體系（楊德全等，２０１１）。ＬＡＭＰ在植物病原菌的檢測(cè)中發(fā)揮極用�；恚欤椋睿螅铮畹葘Ⅳ蓿澹幔欤簦椋恚澹校妹衽cＬＡＭＰ想結(jié)合，建立Ｒｅａｌｔｉｍｅ－ＬＡＭＰ檢測(cè)體速用于灰霉病菌的檢測(cè)。Ｎｉｅｓｓｅｎ等運(yùn)用ＬＡＭＰ技術(shù)能在３０ｍｉｎ成功的從大麥種

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[9]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)的應(yīng)用研究[J]. 劉永生,丁耀忠,張杰.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2010(08)
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碩士論文
[1]哈密瓜細(xì)菌性葉斑病病原鑒定及不同品種抗病性測(cè)定[D]. 高潤蕾.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



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