穩(wěn)定性同位素示蹤復雜土壤中微生物DNA/RNA的技術難點是13C-DNA/RNA的鑒定。本研究針對我國六種典型水稻土,利用穩(wěn)定性同位素13CH4示蹤活性的甲烷氧化菌,超高速密度梯度離心獲得不同浮力密度DNA/RNA后,以甲烷氧化菌獨有的pmo A功能基因和16S r RNA特異基因作為分子標靶,通過半定量凝膠電泳技術評價了特異基因作為分子標靶判定13C-DNA/RNA的可行性,進一步利用克隆文庫技術研究水稻土中的活性甲烷氧化菌群落結構。結果表明:甲烷氧化菌功能基因pmo A作為分子標靶,能夠準確鑒別13C-DNA,而甲烷氧化菌特異的16S r RNA基因則能較好地區(qū)分12C和13C標記的RNA,但13C-RNA中的非目標微生物污染高于13C-DNA示蹤技術。進一步以13C-DNA和13C-RNA為模板,分別構建了pmo A和16S r RNA基因的克隆文庫,系統(tǒng)發(fā)育分析表明I型菌主導了土壤甲烷氧化過程,其中江西鷹潭和黑龍江五常土壤中活性甲烷氧化菌全部屬于Ia型,而四川資陽、浙江嘉興、江蘇常熟和江都土壤中Ia型和Ib型甲烷氧化菌均有發(fā)現(xiàn),并且后者比例較低。這些結果表明分子標靶基因能夠有效... 

【文章來源】：土壤學報. 2016,53(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：12 頁

【部分圖文】：

六種典型水稻土的好氧甲烷氧化過程

http：//pedologica.issas.ac.cn494土壤學報53卷（浙江嘉興）、69.2%（四川資陽）、58.3%（江蘇常熟）、56.0%（黑龍江五常）、44.0%（江蘇江都）。這些結果表明：除江蘇江都水稻土外，Methylocystis（II型）是典型水稻土中的優(yōu)勢甲烷氧化菌。值得注意的是，所有土壤中均未檢測到另一大類Ⅱ型甲烷氧化菌Methylosinus（圖2）。2.3水稻土中甲烷氧化菌13C-DNA/RNA鑒別超高速密度梯度離心獲得不同浮力密度DNA后，通過聚合酶鏈式反應PCR擴增甲烷氧化菌的特異功能基因pmoA，并利用瓊脂糖凝膠電泳開展半定量分析（圖3a）。在重浮力密度DNA中（5～7層），13C-甲烷標記處理樣品中發(fā)現(xiàn)了大量pmoA基因信號，而在相同的位置（5～7層）中，12C-甲烷對照處理樣品未檢測到明顯的pmoA信號（圖3a）。相反，在超高速密度梯度離心試管的上部（9～11層），12C-甲烷處理的不同浮力密度DNA中發(fā)現(xiàn)了大量的pmoA基因擴增產物。這些結果表明：13C-甲烷標記處理土壤中的甲烷氧化菌快速生長并同化了大量的13C合成核酸DNA，在超高速密度梯度離心過程中，這些甲烷氧化菌的13C-DNA與未標記的土壤總DNA分離并遷移聚集在試管下部的重浮力密度離心液中（5～7層）。類似于DNA分析，針對13C-甲烷標記處理和12C-甲烷對照處理的不同浮力密度的RNA，利用好氧甲烷氧化菌16SrRNA引物進行一步法反轉錄擴增（OnestepRNAPCRkit）并進行半定量凝膠電泳分析。結果表明（圖3b），13C-標記處理的重浮力密度（5～7層）RNA中好氧甲烷氧化菌16SrRNA信號明顯強于12C-對照處理，說明好氧甲烷氧化菌利用13CH4合成大量的核糖體13C-RNA。在超高速密度梯度離心過程中，這些標記的核酸分子隨著浮力密度增加遷移至試管下部。然?

http：//pedologica.issas.ac.cn2期鄭燕等：基于核酸DNA/RNA同位素示蹤技術的水稻土甲烷氧化微生物研究495圖3好氧甲烷氧化菌功能基因pmoA擴增產物（a）以及好氧甲烷氧化菌16SrRNA反轉錄擴增產物（b）分別在不同浮力密度DNA和RNA中的分布規(guī)律Fig.3AgarosegelelectrophoresisofpmoAgeneamplicons（a）andmethanotrophic16SrRNAreversetranscriptionamplicons（b）fromtheultracentrifugedDNAandRNAovertheentiredensityrangeofSIP，respectively表213CH4標記和12CH4對照處理重浮力密度RNA中好氧甲烷氧化菌16SrRNA序列比例變化1）Table2Thepercentagechangesofmethanotrophic16SrRNAsequencesinthe‘heavy’RNAfractionsfromthemicrocosmsincubatedwith13CH4and12CH4樣品Sample浮力密度重層Heavyfractions16SrRNA克隆數(shù)Thenumbersof16SrRNAclones好氧甲烷氧化菌占總細菌的比例TherelativeabundanceofMOB（%）13CH412CH413CH412CH4YT51080.0%6121075.0%10.0%71040.0%ZY5887.5%61210100.0%20.0%7683.3%JX51060.0%6101080.0%20.0%71181.8%CS6201950.0%0.0%JD51180.0%69980.0%11.1%7580.0%WC5977.8%69766.7%14.3%71060.0%1）數(shù)據(jù)來源于16SrRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析Thedatawasbasedonthephylogeneticrelationshipof16SrRNAsequences

【參考文獻】：
期刊論文
[1]新一代高通量測序與穩(wěn)定性同位素示蹤DNA/RNA技術研究稻田紅壤甲烷氧化的微生物過程[J]. 鄭燕,賈仲君.  微生物學報. 2013(02)
[2]穩(wěn)定性同位素核酸探針技術DNA-SIP原理與應用[J]. 賈仲君.  微生物學報. 2011(12)
[3]水稻田土壤甲烷氧化活性及其環(huán)境影響因子的研究[J]. 閔航,陳中云,陳美慈.  土壤學報. 2002(05)



本文編號：3273315