發(fā)布時(shí)間：2021-06-08 07:43

　　暗黑鰓金龜Holotrichia parallela Motschulsky是公認(rèn)的難以防治的農(nóng)林重要害蟲,其幼蟲嚴(yán)重為害花生、大豆、馬鈴薯、小麥等農(nóng)作物。蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis（簡稱Bt）是目前世界上應(yīng)用范圍最廣的微生物殺蟲劑。研究表明,Bt產(chǎn)生的伴孢晶體含有殺蟲晶體蛋白,能有效地防治鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等200多種害蟲及動(dòng)植物線蟲。類鈣粘蛋白是一類依賴鈣離子的跨膜糖蛋白,在細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及維持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面發(fā)揮著重要的作用,而且是Bt最重要的受體蛋白。目前,關(guān)于這些方面的研究主要集中在鱗翅目昆蟲,對(duì)于鞘翅目昆蟲的研究很少,尤其是地下害蟲更是少之又少。本研究以暗黑鰓金龜幼蟲為供試對(duì)象,通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RACE以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù),在研究暗黑鰓金龜幼蟲對(duì)Bt蛋白毒力反應(yīng)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)其類鈣粘蛋白基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)量分析,主要研究結(jié)果如下:1、建立瓊脂糖凝膠顆粒生測(cè)體系,在25℃下,用不同濃度的3種Bt蛋白飼喂暗黑鰓金龜5日齡幼蟲,14天后調(diào)查幼蟲死亡情況,結(jié)果表明3種Bt蛋白對(duì)暗黑鰓金龜幼蟲均有一定的殺蟲活性。Cry8E、... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1.文獻(xiàn)綜述
    1.1 暗黑鰓金龜?shù)牧?xí)性
    1.2 發(fā)生與危害
    1.3 暗黑鰓金龜?shù)木C合防治
        1.3.1 化學(xué)防治
        1.3.2 物理防治
        1.3.3 農(nóng)業(yè)防治
        1.3.4 生物防治
            1.3.4.1 真菌類
            1.3.4.2 蘇云金芽孢桿菌
            1.3.4.3 昆蟲病原線蟲
            1.3.4.4 天敵昆蟲
            1.3.4.5 其他防治
    1.4 類鈣粘蛋白
        1.4.1 類鈣粘蛋白的種類和特征
        1.4.2 類鈣粘蛋白作用機(jī)制及研究進(jìn)展
    1.5 本研究的目的與意義
    1.6 研究內(nèi)容及技術(shù)路線
        1.6.1 研究的主要內(nèi)容
        1.6.2 技術(shù)路線
2.試驗(yàn)材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 供試蟲源
        2.1.2 供試菌株
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要試劑
        2.1.5 溶液和培養(yǎng)基配制
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 三種Bt蛋白對(duì)暗黑鰓金龜致死率的影響
            2.2.1.1 Bt孢晶懸液制備
            2.2.1.2 Bt芽孢鏡檢
            2.2.1.3 Bt蛋白的提取
            2.2.1.4 SDS-PAGE電泳檢測(cè)
            2.2.1.5 三種Bt蛋白濃度的測(cè)定（Bradford法）
            2.2.1.6 三種Bt蛋白對(duì)暗黑鰓金龜5日齡幼蟲存活率的影響
            2.2.1.7 數(shù)據(jù)處理
        2.2.2 暗黑鰓金龜3齡幼蟲中腸的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
            2.2.2.1 中腸總RNA的提取
            2.2.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
            2.2.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
        2.2.3 11種擬Bt受體蛋白片段的擴(kuò)增
            2.2.3.1 總RNA的提取
            2.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA
            2.2.3.3 利用特異性引物擴(kuò)增Bt受體蛋白片段
            2.2.3.4 PCR產(chǎn)物回收
            2.2.3.5 PCR回收產(chǎn)物連接至T載體
            2.2.3.6 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            2.2.3.7 陽性克隆驗(yàn)證
        2.2.4 類鈣粘蛋白全長cDNA的克隆
            2.2.4.1 總RNA的提取
            2.2.4.2 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA
            2.2.4.3 PCR擴(kuò)增部分序列
            2.2.4.4 RACE引物設(shè)計(jì)
            2.2.4.5 cDNA3’末端擴(kuò)增—3’ RACE
            2.2.4.6 cDNA 5’末端擴(kuò)增—5’ RACE
            2.2.4.7 質(zhì)粒提取
            2.2.4.9 序列分析
        2.2.5 類鈣粘蛋白相對(duì)表達(dá)量的分析
            2.2.5.1 類鈣粘蛋白、內(nèi)參基因定量引物設(shè)計(jì)及片段的擴(kuò)增
            2.2.5.2 熒光定量PCR反應(yīng)
            2.2.5.3 數(shù)據(jù)處理
3.結(jié)果與分析
    3.1 Bt蛋白對(duì)暗黑鰓金龜5日齡幼蟲存活率的影響
        3.1.1 Bt蛋白的提取
        3.1.2 三種Bt蛋白濃度的測(cè)定
        3.1.3 三種Bt蛋白對(duì)暗黑鰓金龜幼蟲致死率的影響
    3.2 暗黑鰓金龜幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
        3.2.1 暗黑鰓金龜幼蟲中腸總RNA的提取
        3.2.2 暗黑鰓金龜3齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組分析
            3.2.2.1 暗黑鰓金龜3齡幼蟲中腸Unigene親緣性分析
            3.2.2.2 暗黑鰓金龜幼蟲中腸Unigene的KOG分析
            3.2.2.3 暗黑鰓金龜幼蟲中腸Unigene的GO分析
            3.2.2.4 暗黑鰓金龜幼蟲中腸APN和類鈣粘蛋白進(jìn)化樹的建立
    3.3 11種擬Bt受體蛋白片段的克隆
    3.4 類鈣粘蛋白全長cDNA的克隆
        3.4.1 類鈣粘蛋白cDNA片段擴(kuò)增
        3.4.2 類鈣粘蛋白cDNA全長擴(kuò)增
        3.4.3 暗黑鰓金龜幼蟲類鈣粘蛋白基因序列分析
        3.4.4 暗黑鰓金龜幼蟲類鈣粘蛋白同源性分析
    3.5 類鈣粘蛋白基因表達(dá)量分析
        3.5.1 引物特異性檢測(cè)
        3.5.2 不同齡期類鈣粘蛋白相對(duì)表達(dá)量分析
        3.5.3 3齡幼蟲不同組織類鈣粘蛋白相對(duì)表達(dá)量分析
4.結(jié)論
5.討論
參考文獻(xiàn)
附錄 1
附錄 2
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]青島地區(qū)暗黑鰓金龜性信息素鑒定及田間應(yīng)用技術(shù)[J]. 鞠倩,李曉,姜曉靜,趙志強(qiáng),蔣相國,倪皖莉,曲明靜.  植物保護(hù)學(xué)報(bào). 2014(02)
[2]夏大豆田暗黑鰓金龜發(fā)生危害規(guī)律研究[J]. 史樹森,崔娟,宋鵬翔,臧冬初,李維宇,武婷婷.  大豆科學(xué). 2014(01)
[3]鈣粘蛋白與蘇云金芽胞桿菌晶體毒素互作機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 趙新民,周攀登,劉淑云,徐玲,夏莉,夏立秋,孫運(yùn)軍.  微生物學(xué)通報(bào). 2013(04)
[4]綠僵菌防治蠐螬的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 于永浩,龍秀珍,曾憲儒,韋德衛(wèi),曾濤.  南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2013(01)
[5]60%吡蟲啉懸浮種衣劑防治花生田蠐螬試驗(yàn)初報(bào)[J]. 周長勇,汪立新,周平.  安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)(下半月刊). 2012(20)
[6]吡蟲啉懸浮種衣劑對(duì)花生蠐螬防治效果的研究[J]. 謝吉先,王書勤,陳志德.  農(nóng)業(yè)科技通訊. 2012(06)
[7]金龜子綠僵菌CQMa128新制劑對(duì)花生蠐螬的田間防控效果[J]. 殷幼平,申劍飛,時(shí)玉娟,劉美昌,邵長文,王中康.  植物保護(hù). 2012(03)
[8]淺談蠐螬對(duì)草坪的危害[J]. 張震,趙曄.  現(xiàn)代園藝. 2012(06)
[9]蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白研究綜述[J]. 黎婭.  武漢生物工程學(xué)院學(xué)報(bào). 2012(01)
[10]杭州地區(qū)藍(lán)莓上金龜子的發(fā)生與防治[J]. 李明江,黃俊,沈福泉,陳常理,朱開元,周新生.  現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技. 2011(16)

博士論文
[1]對(duì)金龜甲科、葉甲科害蟲高毒力蘇云金芽胞桿菌殺蟲基因及工程菌的研究[D]. 閆貴欣.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2009

碩士論文
[1]二化螟中腸類鈣粘蛋白基因的功能分析[D]. 杜立嘯.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014
[2]Cry8Ga1和Cry8Ea1蛋白毒殺蠐螬的生理生化機(jī)制研究[D]. 譚樹乾.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2013
[3]蠐螬高致病力綠僵菌菌株的鑒定篩選與新制劑的田間應(yīng)用技術(shù)研究[D]. 申劍飛.重慶大學(xué) 2011
[4]昆蟲病原線蟲的篩選鑒定及其對(duì)蠐螬的致病性研究[D]. 劉樹森.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2009
[5]對(duì)鞘翅目害蟲有活性Bt菌株的篩選及cry8Ea2基因的克隆、表達(dá)和活性研究[D]. 劉興龍.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[6]金龜子綠僵菌的生物學(xué)及其在花生蠐螬防治中的應(yīng)用[D]. 王萍莉.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006



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