油菜菌核病是一種世界性病害,其病原為核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。在我國,該病菌寄主范圍非常廣泛,能侵染包括75科278屬400余種植物。目前,油菜菌核病的防治主要以化學防治為主�？┚孀鳛橐环N新型的苯吡咯類殺菌劑對油菜菌核病具有良好的防效,但該藥劑在我國油菜菌核病的防治上尚未進行登記,同時,咯菌腈對核盤菌的作用機制尚不明確。本實驗室已有研究表明,咯菌腈對核盤菌的作用機制與核盤菌的雙組分信號系統(tǒng)有關,而RRG-1和RRG-2是雙組分信號系統(tǒng)中兩個重要的效應調控因子。因此,本文首先系統(tǒng)優(yōu)化了核盤菌原生質體的制備與PEG介導的遺傳轉化體系；然后,利用該體系分別構建了基因敲除突變體及其回復突變體來研究RRG-1和RRG-2的生物學功能,進一步明確RRG-1和RRG-2對咯菌腈敏感性的調控機制。該研究將對油菜菌核病的綜合防控、研發(fā)原創(chuàng)性殺菌劑具有重要意義。1.本文系統(tǒng)優(yōu)化了核盤菌原生質體的制備條件及PEG介導的原生質體遺傳轉化體系。經優(yōu)化,確定制備原生質體的最佳條件為：在25℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中用YEPD液體培養(yǎng)基175 r/min震蕩培養(yǎng)出發(fā)菌株36 h；先用滅菌... 

【文章來源】：南京農業(yè)大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：122 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號及縮略說明表
第一章 綜述
    1 油菜菌核病及防治研究現狀
        1.1 核盤菌概況
        1.2 核盤菌生活史
        1.3 油菜菌核病防治現狀
            1.3.1 育種防治現狀
            1.3.2 生物防治現狀
            1.3.3 農業(yè)防治現狀
            1.3.4 化學防治現狀
    2 絲狀真菌效應調控因子RRG-1、RRG-2的研究概況
        2.1 絲狀真菌效應調控因子RRG-1
        2.2 絲狀真菌效應調控因子RRG-2
    3 苯吡咯類殺菌劑研究概況
    4 本研究的目的和意義
    參考文獻
第二章 核盤菌原生質體制備與遺傳轉化體系的優(yōu)化
    摘要
    1 材料與方法
        1.1 菌株、質粒、培養(yǎng)基與試劑
        1.2 轉化片段
        1.3 原生質體制備條件的優(yōu)化
            1.3.1 菌絲培養(yǎng)條件的篩選
            1.3.2 菌絲培養(yǎng)時間的優(yōu)化
            1.3.3 不同裂解酶組合的優(yōu)化
            1.3.4 裂解酶濃度的優(yōu)化
            1.3.5 酶解緩沖液的優(yōu)化
            1.3.6 酶解時間的優(yōu)化
            1.3.7 酶解溫度的優(yōu)化
            1.3.8 收集原生質體離心轉速的優(yōu)化
        1.4 再生培養(yǎng)條件的優(yōu)化
            1.4.1 再生培養(yǎng)基(RM)的優(yōu)化
            1.4.2 覆蓋培養(yǎng)基(SRM)的優(yōu)化
        1.5 PCR分析驗證
    2 結果與分析
        2.1 原生質體制備條件的優(yōu)化
            2.1.1 菌絲培養(yǎng)條件的篩選
            2.1.2 菌絲培養(yǎng)時間的優(yōu)化
            2.1.3 不同酶組合的優(yōu)化
            2.1.4 裂解酶濃度的優(yōu)化
            2.1.5 酶解緩沖液的優(yōu)化
            2.1.6 酶解時間的優(yōu)化
            2.1.7 酶解溫度的優(yōu)化
            2.1.8 離心收集原生質體轉速的優(yōu)化
        2.2 再生培養(yǎng)條件的優(yōu)化
            2.2.1 再生培養(yǎng)基(RM)的優(yōu)化
            2.2.2 覆蓋培養(yǎng)基(SRM)的優(yōu)化
    3 討論
    參考文獻
    ABSTRACT
第三章 核盤菌效應調控因子SsRRG-1的生物學功能分析
    摘要
    1 材料和方法
        1.1 供試菌株、質粒、殺菌劑與培養(yǎng)基
        1.2 供試試劑
        1.3 核盤菌效應調控因子SsRRG-1的鑒定及序列分析
        1.4 核盤菌SsRRG-1基因敲除載體的構建
        1.5 原生質體的制備與遺傳轉化
            1.5.1 核盤菌原生質體的制備
            1.5.2 原生質體的轉化
        1.6 轉化子的驗證
            1.6.1 潮霉素藥劑驗證
            1.6.2 PCR驗證
            1.6.3 Southern雜交驗證
        1.7 敲除突變體的互補驗證
        1.8 表型分析
            1.8.1 對咯菌腈的敏感性測定
            1.8.2 菌絲生長速率測定、產菌核情況及菌絲顯微形態(tài)觀察
            1.8.3 對氧化壓、滲透壓、離子脅迫的敏感性測定
            1.8.4 對細胞壁抑制劑的敏感性測定
            1.8.5 菌絲電導率測定
            1.8.6 菌絲胞內甘油合成測定
            1.8.7 致病力測定
            1.8.8 侵染墊形成試驗
            1.8.9 草酸合成測定
        1.9 SsRRG-1基因敲除對上下游基因表達的影響
            1.9.1 菌絲樣品的制備
            1.9.2 樣品RNA的提取
            1.9.3 熒光定量實時PCR
    2 結果與分析
        2.1 核盤菌SsRRG-1基因的鑒定及序列分析
        2.2 載體構建
        2.3 轉化子驗證
        2.4 敲除突變體表型分析
            2.4.1 對咯菌腈敏感性測定
            2.4.2 菌絲生長速率測定、產菌核情況及菌絲顯微形態(tài)觀察
            2.4.3 測定ΔSsRRG-1敲除突變體對滲透壓、氧化壓、離子脅迫的敏感性
        2.5 細胞膜透性測定
        2.6 胞內甘油含量測定
        2.7 細胞壁抑制劑敏感性測定
        2.8 致病力測定
        2.9 SsRRG-1基因敲除后對其上下游基因表達的影響
    3 討論
    參考文獻
    ABSTRACT
第四章 核盤菌效應調控因子SsRRG-2的基因功能分析
    摘要
    1 材料和方法
        1.1 供試菌株、質粒、殺菌劑與培養(yǎng)基
        1.2 供試試劑
        1.3 核盤菌RRG-2基因的鑒定及序列分析
        1.4 核盤菌RRG-2基因敲除載體的構建
        1.5 原生質體的制備與遺傳轉化
        1.6 轉化子的驗證
            1.6.1 潮霉素藥劑驗證
            1.6.2 PCR驗證
            1.6.3 Southern雜交驗證
        1.7 敲除突變體的互補驗證
        1.8 表型分析
        1.9 SsRRG-2基因敲除對上下游基因表達的影響
    2 結果與分析
        2.1 核盤菌SsRRG-2基因的鑒定及序列分析
        2.2 核盤菌SsRRG-2基因敲除載體的構建
        2.3 轉化子驗證
        2.4 敲除突變體表型分析
            2.4.1 對殺菌劑敏感性測定
            2.4.2 菌絲生長速率測定、產菌核情況及菌絲顯微形態(tài)觀察
            2.4.3 測定ΔSsRRG-2敲除突變體對滲透壓、氧化壓、離子脅迫的敏感性
        2.5 細胞膜透性測定
        2.6 胞內甘油含量測定
        2.7 細胞膜、細胞壁抑制劑敏感性測定
        2.8 致病力
        2.9 SsRRG-2基因敲除后對其上下游基因表達的影響
    3 討論
    參考文獻
    ABSTRACT
全文小結
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文及專利
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3193590