本研究旨在探討L-賴氨酸脫羧酶Ldc1E關(guān)鍵氨基酸在底物識別和催化過程中的作用;通過生物信息學(xué)方法選擇突變位點,并利用直接定點突變技術(shù),完成了6個關(guān)鍵氨基酸殘基突變和功能鑒定研究。突變酶D692N最適溫度和pH值分別為40℃和6.5。突變酶D692N比野生型Ldc1E對高溫具有更強的耐受性,在40℃～55℃溫浴1 h后剩余酶活力達(dá)到35%以上,在60℃溫浴1 h后仍然保留20%的酶活力;而野生型酶Ldc1E在50℃以上溫浴1 h后幾乎失活。此外,50 mmol/L DMSO、5 mmol/L Al³⁺和Ca²⁺對突變酶的酶活力有激活作用,而Al3+對野生型酶Ldc1E具有明顯抑制作用。突變酶D692N的分子動力學(xué)常數(shù)K_m升高了1.78倍,k_cat下降了20.2倍。突變酶S221A、H245A、D330A、H366A、F607Y經(jīng)檢測酶催化活性喪失。研究結(jié)果表明氨基酸殘基位點D692對酶與底物的結(jié)合具有重要影響;而S221、H245、D330、H366、F607是Ldc1E酶活性能夠體現(xiàn)的關(guān)鍵氨基酸位... 

【文章來源】：基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2020,39(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【文章目錄】：
1 結(jié)果與分析
    1.1 分子對接
    1.2 ldc1E定點突變
    1.3 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化
    1.4 突變酶D692N的酶學(xué)特性
        1.4.1 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性
        1.4.2 最適反應(yīng)pH值
        1.4.3 不同化學(xué)試劑和金屬離子對酶活性的影響
        1.4.4 不同濃度PLP對酶活性的影響
        1.4.5 酶動力學(xué)參數(shù)
2 討論
3 材料與方法
    3.1 酶與試劑
    3.2 突變體庫的構(gòu)建
    3.3 重組蛋白表達(dá)及活性測定
    3.4 生物信息學(xué)分析
    3.5 酶學(xué)性質(zhì)研究
        3.5.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測定
        3.5.2 最適反應(yīng)pH測定
        3.5.3 不同化學(xué)試劑和金屬離子對酶活力的影響
        3.5.4 同濃度PLP對酶活力的影響
        3.5.5 酶動力學(xué)參數(shù)測定
作者貢獻(xiàn)


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]通過宏基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)生物催化劑[J]. 彭司華,孫丹,袁文亮,衛(wèi)偲.  應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報. 2019(02)
[2]銀翹散中抗流感病毒成分與神經(jīng)氨酸酶的分子對接研究[J]. 郭小華,朱燕亮,程齊來.  中國藥房. 2018(17)
[3]生物酶法合成1,5-戊二胺的研究進(jìn)展[J]. 鄧潔,高震,高華,吳巧芬,蔣承建.  廣西科學(xué). 2017(01)
[4]一株產(chǎn)賴氨酸脫羧酶的菌株Klebsiella pneumoniae sp.GXW-1的鑒定[J]. 楊穎,鄧潔,張亮,蔣承建,歐倩,申佩弘,武波.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2015(12)
[5]生物法制備1,5-戊二胺的研究進(jìn)展[J]. 張凱,蔡恒,汪晨,張恒麗.  現(xiàn)代化工. 2012(10)

博士論文
[1]賴氨酸脫羧酶高效表達(dá)、分子定向進(jìn)化及其催化合成戊二胺的反應(yīng)過程特性[D]. 李乃強.江南大學(xué) 2016



本文編號：3190806