玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63是一株從馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤中分離的生防菌，能夠產(chǎn)生多種脂溶性抗生素，對多種植物病原真菌有抑制作用。A-因子及其類似物作為一種微生物激素廣泛存在于多種鏈霉菌中，其上均含有一個γ-丁酸酯環(huán)結(jié)構(gòu)。A-因子及其類似物對鏈霉菌的代謝和菌體形態(tài)分化具有重大調(diào)控作用，可調(diào)控鏈霉菌的氣生菌絲生長、孢子形成以及次級代謝產(chǎn)物的形成。研究發(fā)現(xiàn)afsA基因家族能夠編碼鏈霉菌A-因子及其類似物合成過程中的一種關(guān)鍵酶。本實驗室前期工作中將玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63抗生素合成基因簇定位于其線性質(zhì)粒pSR47上，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)pSR47含有afsA家族基因srpA。本研究通過基因敲除技術(shù)進行srpA基因的功能分析。主要研究結(jié)果如下：1)構(gòu)建srpA基因敲除載體pKC1139-srpAF-tsr-srpAR，應(yīng)用接合轉(zhuǎn)移技術(shù)將pKC1139-srpAF-tsr-srpAR轉(zhuǎn)入玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63，初篩獲得硫鏈絲菌素抗性突變株。2)分別提取野生株和srpA突變株48h、60h、72h、84h菌絲體總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測。發(fā)現(xiàn)不同時... 

【文章來源】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫詞表
1 引言
    1.1 玫瑰黃鏈霉菌研究進展
    1.2 A-因子及其類似物
    1.3 afsA 基因家族是 A-因子及其結(jié)構(gòu)類似物生物合成途徑中的關(guān)鍵基因
    1.4 基因功能研究方法—基因敲除與基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)
    1.5 本研究的目的及意義
2 材料
    2.1 菌株和質(zhì)粒
    2.2 PCR 引物
    2.3 限制性內(nèi)切酶與試劑盒
    2.4 分子量標(biāo)準(zhǔn)
    2.5 抗生素
    2.6 培養(yǎng)基
    2.7 緩沖液及試劑
    2.8 常用儀器設(shè)備
3 方法
    3.1 玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63 的菌種保存
    3.2 玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63 孢子懸浮液的制備
    3.3 堿裂解法鏈霉菌質(zhì)粒提取[67,79]
    3.4 srpA 基因的克隆及原核表達
        3.4.1 srpA 基因特異引物的設(shè)計
        3.4.2 srpA 的 PCR 擴增
        3.4.3 srpA 基因原核重組表達載體的構(gòu)建[70,79,80]
        3.4.4 陽性克隆的篩選
        3.4.5 srpA 基因序列的測定與分析
        3.4.6 srpA 基因在 E. coli M15 中的誘導(dǎo)表達
        3.4.7 SrpA 蛋白檢測
    3.5 玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63 srpA 基因的敲除
        3.5.1 srpA 基因敲除載體的構(gòu)建
        3.5.2 鏈霉菌-大腸桿菌之間的接合轉(zhuǎn)移
        3.5.3 突變菌株的篩選驗證
        3.5.4 srpA 基因功能分析
4 結(jié)果與分析
    4.1 srpA 基因的克隆及原核表達
        4.1.1 目的基因 srpA 的克隆
        4.1.2 srpA 基因的序列分析
        4.1.3 重組表達載體 pQE30-srpA 的構(gòu)建
        4.1.4 srpA 基因在 E. coli 中的誘導(dǎo)表達與檢測
    4.2 玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63 srpA 基因的敲除
        4.2.1 srpAF、srpAR 的克隆
        4.2.2 tsr 基因克隆
        4.2.3 srpA 敲除載體 pKC1139-srpAF-tsr-srpAR 的驗證
        4.2.4 野生型及突變株玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63 中 srpA 轉(zhuǎn)錄分析
        4.2.5 srpA 缺失對鏈霉菌 Men-myco-93-63 液態(tài)培養(yǎng)條件下菌體生長的影響
        4.2.6 srpA 缺失對鏈霉菌 Men-myco-93-63 菌落形態(tài)的影響
        4.2.7 srpA 缺失對鏈霉菌 Men-myco-93-63 抗生素生產(chǎn)能力的影響
5 討論
6 結(jié)論
7 參考文獻
作者簡歷
致謝
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文:


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]鏈霉菌分化負(fù)調(diào)節(jié)基因nsdA在抗生素高產(chǎn)育種上的應(yīng)用[D]. 王茜.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004



本文編號：3188247