灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一類世界性分布的死體營養(yǎng)型植物病原真菌,可侵染1,000多種植物,引起灰霉�。╣rey mould disease）,每年給農業(yè)生產造成嚴重的經濟損失。由于其巨大的經濟影響和科學價值,灰葡萄孢目前也已經成為研究死體營養(yǎng)型病原真菌的重要模式真菌。菌核是灰葡萄孢度過不良環(huán)境和繁殖的菌絲體結構,也是灰霉病的重要初侵染來源,抑制菌核的形成將切斷灰霉病的病害循環(huán)。因此,研究灰葡萄孢菌核形成相關基因的功能和揭示菌核形成的分子機理將為灰霉病的有效防治提供新的理論依據。為了篩選出灰葡萄孢菌核形成相關的基因,利用轉錄組測序技術比較分析了灰葡萄孢菌絲生長階段和菌核形成階段的差異表達基因,結果發(fā)現與菌絲生長階段相比,兩次生物學重復分別有1318和1249個基因在菌核形成階段顯著上調表達,有853和943個基因顯著下調表達,推測其中有些基因可能在菌核發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。以RNA-Seq測序數據為基礎,根據基因表達水平篩選出了10個在菌核形成階段明顯上調表達的基因和1個明顯下調表達的基因進行深入研究。首先利用RT-PCR檢測了菌核形成過程中目標基因的表達水平,結... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：139 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 灰葡萄孢和植物灰霉病
        1.1 灰葡萄孢及其經濟重要性
        1.2 灰葡萄孢的生活史與病害循環(huán)
        1.3 灰葡萄孢的致病機理研究
            1.3.1 灰葡萄孢的侵染結構
            1.3.2 灰葡萄孢的致病因子
            1.3.3 灰葡萄孢致病過程中的信號調控
    2 灰葡萄孢的菌核及形成機理
        2.1 菌核的結構與功能
        2.2 灰葡萄孢的菌核形成相關因子
            2.2.1 菌核形成相關的環(huán)境因子
            2.2.2 菌核形成相關的信號轉導通路
    3 灰霉病的防治
        3.1 化學防治
        3.2 農業(yè)防治
        3.3 生物防治
    4 枯草桿菌蛋白酶類似蛋白酶的研究進展
        4.1 枯草桿菌蛋白酶類似蛋白酶家族概況
        4.2 枯草桿菌蛋白酶類似蛋白酶在病原真菌中的研究進展
    5 研究目的與意義
第二章 灰葡萄孢轉錄組測序及分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
            1.1.1 試驗菌株
            1.1.2 試驗試劑和儀器
        1.2 試驗方法
            1.2.1 灰葡萄孢菌核形成相關樣品的總RNA提取
            1.2.2 灰葡萄孢菌核形成相關測序文庫的構建
            1.2.3 測序數據預處理
            1.2.4 測序Reads比對到灰葡萄孢基因組及差異表達基因的篩選
            1.2.5 差異表達基因的層次聚類分析
            1.2.6 差異表達基因的功能富集分析
    2 結果與分析
        2.1 轉錄組測序樣品收集
        2.2 Illumina RNA-Seq測序數據質量評估
        2.3 灰葡萄孢差異基因的檢測
        2.4 差異基因功能富集分析
            2.4.1 DEGs的GO功能分析
            2.4.2 DEGs的Pathway通路分析
    3 結論與討論
第三章 部分差異表達基因的敲除及其生物學功能的初步探究
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
            1.1.1 試驗菌株
            1.1.2 培養(yǎng)基和試劑
        1.2 試驗方法
            1.2.1 灰葡萄孢基因組DNA的提取
            1.2.2 灰葡萄孢總RNA的提取
            1.2.3 第一鏈cDNA的合成
            1.2.4 實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)
            1.2.5 灰葡萄孢基因的敲除策略
            1.2.6 灰葡萄孢原生質體制備
            1.2.7 PEG介導灰葡萄孢原生質體轉化
            1.2.8 灰葡萄孢敲除轉化子的驗證策略
            1.2.9 灰葡萄孢敲除轉化子的單孢純化
            1.2.10 高鹽法提取灰葡萄孢基因組DNA
            1.2.11 Southern blot分析
            1.2.12 灰葡萄孢菌絲生長速度的測定
            1.2.13 灰葡萄孢菌落形態(tài)和的觀察
            1.2.14 灰葡萄孢產酸能力的定性測定
            1.2.15 灰葡萄孢菌核形成的測定
            1.2.16 灰葡萄孢致病力的測定
    2 結果與分析
        2.1 灰葡萄孢菌核形成相關候選基因的選擇
        2.2 灰葡萄孢菌核形成相關候選基因的表達模式分析
            2.2.1 候選基因在菌核形成階段的表達模式
            2.2.2 候選基因在致病階段的表達模式
        2.3 灰葡萄孢菌核形成相關候選基因敲除轉化子的獲得
            2.3.1 候選基因敲除載體的構建
            2.3.2 PEG介導原生質體轉化
            2.3.3 菌核形成相關候選基因敲除轉化子的驗證
            2.3.4 敲除轉化子的單孢純化及PCR驗證
            2.3.5 灰葡萄孢基因敲除轉化子的Southern blot驗證
        2.4 灰葡萄孢菌核形成相關候選基因敲除轉化子的生物學特性研究
            2.4.1 候選基因敲除轉化子的菌落形態(tài)觀察
            2.4.2 候選基因敲除轉化子生長速度的測定
            2.4.3 候選基因敲除轉化子菌核形成能力的測定
            2.4.4 候選基因敲除轉化子致病力的測定
            2.4.5 灰葡萄孢基因敲除轉化子產酸的定性測定
    3 結論與討論
第四章 枯草桿菌蛋白酶類似蛋白酶的功能研究
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
            1.1.1 試驗菌株
            1.1.2 培養(yǎng)基
        1.2 試驗方法
            1.2.1 灰葡萄孢基因Bcser2的敲除
            1.2.2 灰葡萄孢基因Bcser2的互補試驗
            1.2.3 灰葡萄孢菌核形成的測定
            1.2.4 灰葡萄孢致病力的測定
            1.2.5 灰葡萄孢侵染結構的觀察
            1.2.6 灰葡萄孢在逆境條件下的生長測定
            1.2.7 灰葡萄孢菌絲尖端觀察
    2 結果與分析
        2.1 灰葡萄孢Bcser1和Bcser2蛋白結構分析
        2.2 灰葡萄孢Bcser1和Bcser2基因表達模式
        2.3 灰葡萄孢基因Bcser2的敲除及Bcser1和Bcser2的雙敲除
        2.4 灰葡萄孢基因Bcser2的互補試驗
        2.5 基因Bcser1和Bcser2轉化子的生物學特性
        2.6 基因Bcser2參與灰葡萄孢分生孢子的形成
        2.7 基因Bcser2參與灰葡萄孢菌核的形成
        2.8 基因Bcser2在灰葡萄孢致病力過程中發(fā)揮重要作用
        2.9 基因Bcser2參與灰葡萄孢侵染墊的形成
        2.10 基因Bcser2參與灰葡萄孢對pH脅迫的耐受作用
    3 結論與討論
第五章 結論與展望
    1 全文結論
    2 研究展望
參考文獻
附錄1
附錄2
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]番茄灰霉病生物防治的研究進展[J]. 馬晨,周欣玥,王全.  園藝與種苗. 2018(02)
[2]番茄灰霉病防治研究進展[J]. 紀軍建,張小風,王文橋,張金林.  中國農學通報. 2012(31)
[3]葡萄灰霉病研究進展[J]. 陳宇飛,文景芝,李立軍.  東北農業(yè)大學學報. 2006(05)
[4]國內保護地蔬菜灰霉病侵染規(guī)律及防治技術研究進展[J]. 楊燕濤.  農藥. 2003(01)



本文編號：3179596