微生物宏基因組（Metagenome）是指某一生境中所有微生物遺傳物質(zhì)的總和。土壤中存在大量資源微生物，但99%的微生物不能在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)存在很大的弊端。宏基因組技術(shù)繞過培養(yǎng)的限制，為活性物質(zhì)及功能基因的篩選提供了一條新的思路。本研究以浙江天目山土壤為材料，摸索土壤細(xì)菌宏基因組DNA的提取方法，構(gòu)建了天目山土壤宏基因組文庫(kù)并進(jìn)行了功能基因的篩選，克隆得到了一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因。詳細(xì)結(jié)果如下：1.比較分析了不同土壤細(xì)菌DNA提取方法，通過優(yōu)化得到了土壤細(xì)菌DNA提取的最佳方案，提取獲得的DNA可以滿足粘粒文庫(kù)構(gòu)建需求。通過比較分析分散后差速離心處理、分散后蔗糖梯度密度離心、瓊脂糖凝膠包埋法、裂解法、透析袋法、凍融法等細(xì)菌細(xì)胞提取及DNA提取方法，總結(jié)出了土壤細(xì)菌DNA提取純化的最佳方法：用0.2%焦磷酸鈉溶液混勻土壤，在攪拌器中勻漿分散，勻漿后的土壤溶液600×g低速離心，所得上清10,000×g高速離心獲得土壤細(xì)菌，采用CTAB堿裂解法，高溫輔助裂解，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠與瓊脂糖酶消化相結(jié)合回收土壤DNA。2.構(gòu)建了基于粘粒的天目山土壤細(xì)菌宏基因組文庫(kù)。將提取獲得DNA進(jìn)... 

【文章來源】：浙江農(nóng)林大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1 文獻(xiàn)綜述
        1.1 宏基因組文庫(kù)
            1.1.1 宏基因組文庫(kù)概念
            1.1.2 宏基因組文庫(kù)的應(yīng)用
            1.1.3 宏基因組文庫(kù)技術(shù)
                1.1.3.1 土壤宏基因組文庫(kù)構(gòu)建
                1.1.3.2 文庫(kù)分析篩選
            1.1.4 宏基因組文庫(kù)在篩選生物活性物質(zhì)方面的研究進(jìn)展
        1.2 浙江天目山土壤微生物研究
            1.2.1 天目山獨(dú)特的自然環(huán)境
            1.2.2 天目山土壤微生物研究進(jìn)展
        1.3 幾丁質(zhì)酶
            1.3.1 幾丁質(zhì)酶概述
            1.3.2 幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用
            1.3.3 幾丁質(zhì)酶基因的篩選克隆
    2 本課題的研究目的和意義
    3 本課題的研究技術(shù)路線
第二章 天目山土壤宏基因組文庫(kù)構(gòu)建
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 土壤樣品
            1.1.2 菌株、質(zhì)粒
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
            1.1.5 土壤細(xì)菌洗滌液配制
            1.1.6 提取基因組 DNA 所需溶液
            1.1.7 文庫(kù)構(gòu)建所用溶液
        1.2 方法
            1.2.1 土壤細(xì)菌 DNA 提取與純化
                1.2.1.1 土壤分散
                1.2.1.2 細(xì)菌提取
                1.2.1.3 土壤細(xì)菌洗滌
                1.2.1.4 提取土壤微生物總 DNA 方法比較
                1.2.1.5 DNA 質(zhì)量檢測(cè)
                1.2.1.6 土壤宏基因組純化方法比較
                1.2.1.7 純化后土壤宏基因組質(zhì)量檢測(cè)
            1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建
                1.2.2.1 土壤細(xì)菌 DNA 片段酶切及篩選
                1.2.2.2 載體制備
                1.2.2.3 酶切基因組、粘粒載體質(zhì)量檢測(cè)
                1.2.2.4 連接
                1.2.2.5 包裝
                1.2.2.6 滴度測(cè)定與轉(zhuǎn)染
            1.2.3 文庫(kù)保存
            1.2.4 文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)
    2 結(jié)果與分析
        2.1 摸索了土壤細(xì)菌細(xì)胞、DNA 的提取及純化條件，確定了土壤細(xì)菌宏基因組DNA 提取的最佳方法
        2.2 天目山土壤細(xì)菌宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建
    3 小結(jié)
第三章 文庫(kù)篩選與幾丁質(zhì)酶的基因克隆
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 供試菌株、質(zhì)粒
            1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
            1.1.3 實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基配制
        1.2 方法
            1.2.1 幾丁質(zhì)酶活性克隆篩選
            1.2.2 典型克隆拮抗病原真菌效果測(cè)定
            1.2.3 粘粒測(cè)序及幾丁質(zhì)酶基因分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 幾丁質(zhì)降解菌株的篩選
        2.2 幾丁質(zhì)降解菌株粘粒文庫(kù)基因分析
    3 小結(jié)
第四章 結(jié)論與討論
    1 結(jié)論與討論
    2 下一步工作
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
附錄



本文編號(hào)：3176405