多殺菌素是土壤放線菌刺糖多孢菌經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物,具有較高的殺蟲活性。因其兼具生物農(nóng)藥的安全性和化學農(nóng)藥的速效性,在防治農(nóng)作物害蟲和儲糧害蟲方面有良好的應用價值和廣闊的市場前景。關(guān)于刺糖多孢菌分子水平改造的報道很少,其主要原因是刺糖多孢菌具有很強的限制修飾系統(tǒng),外源DNA很難導入。在刺糖多孢菌生長緩慢、遺傳轉(zhuǎn)化困難的情況下,選擇遺傳背景清晰、生長迅速、發(fā)酵技術(shù)成熟的鏈霉菌作為異源宿主,對多殺菌素合成基因簇進行異源表達,有望提高多殺菌素產(chǎn)量,并研究其表達調(diào)控的機理。通過構(gòu)建刺糖多孢菌BAC文庫,獲得了含有完整spn基因簇的pCC1BAC質(zhì)粒。將大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pSET152上接合轉(zhuǎn)移所需的相關(guān)基因和參與多殺菌素合成的鼠李糖合成基因通過Red/ET插入到含有spn基因簇的BAC質(zhì)粒上,構(gòu)成了異源表達質(zhì)粒。以天藍色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌等鏈霉菌作為異源宿主菌,成功地構(gòu)建了產(chǎn)多殺菌素的基因工程菌。進一步對刺糖多孢菌進行遺傳改造和調(diào)控基因研究,建立并優(yōu)化了刺糖多孢菌的接合轉(zhuǎn)移方法。工業(yè)上所用的培養(yǎng)基的碳源主要是淀粉類物質(zhì),但是刺糖多孢菌對淀粉的利用效率很低。研究表明,菌體對淀... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學福建省

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－４多殺菌素Ｉ型聚酮合成酶（ＰＫＳ）結(jié)構(gòu)圖％??Ｆｉｇ?１－４?Ｍｏｄｕｌａｒ?ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｓｐｉｎｏｓｙｎ?ＰＫＳ?ｇｅｎｅ?ｃｌｕｓｔｅｒ??

－ｒａｃｅ?ＰＣＲ實驗結(jié)果，刺糖多孢菌的??生物合成基因簇共有９個轉(zhuǎn)錄子，轉(zhuǎn)錄子結(jié)構(gòu)如圖所示。??５２ｂｐ?２?３３１?８?２０３?１３?５?４５４?１７?３４?３６２??＼?ｆ＼Ｌ?｜＼ｈ?（Ｋｆ?Ａ?＼?（：?＼?Ｅ?＼?Ｒ２???？??？???＾?七??６＾４?１?＞１６、５、４?＼、９?＼ｌ５?Ｒ?＾４?Ｄ?、〇?Ｒ１、２。??＂Ｔ?一?￣￣１—＂Ｖ＂—?￣ｖｎ?一ｌｘ＂??一?ｘｉｌＴ??ＩＩ?ＩＶ?ｖｉ?ＶＩＩＩ?Ｘ?ＸＩ?ＸＩＩ??圖２－１多殺菌素生物合成基因簇轉(zhuǎn)錄子結(jié)構(gòu)分析??Ｆｉｇ?２－１?Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｐｉｎｏｓｙｎ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｃｌｕｓｔｅｒ??（黑色箭頭表示了?．Ｖｍ基因簇中各個基因的大小和方向，阿拉伯數(shù)字表示了各個基因之間的距離，紅色線??條代表了轉(zhuǎn)錄子結(jié)構(gòu)）??根據(jù)ＮＣＢＩ上刺糖多孢菌生物合成基因簇的序列信息，設計擴增５／７／７基因簇??每個轉(zhuǎn)錄子中的１００－１５０ｂｐ大小的片段，退火溫度在均在６０°Ｃ以上。對于多順反??子，用位于轉(zhuǎn)錄子中部的基因的轉(zhuǎn)錄水平來代表整個轉(zhuǎn)錄子的轉(zhuǎn)錄水平。設計引??物序列：??表２－３ＲＴ－ＰＣＲ引物??Ｔａｂｌｅ?２－３?Ｐｒｉｍｅｒｓ?ｆｏｒ?ＲＴ－ＰＣＲ??Ｐｒｉｍｅｒ?Ｐｒｉｍｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?（?５＇—＾３＇）??ｓｐｎＰ－Ｆ?ＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＴＴＧＧＡ??ｓｐｎＰ－Ｒ?ＴＧＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＧＣＴＴＧＧＴＣ??ｓｐｎＭ－Ｆ?ＡＴＣＴＣＧＴＣＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧ??ｓｐｎＭ－Ｒ?ＧＣＧＡＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＡＣＴＴＣＣ??ｓｐｎｌ－Ｆ

福建農(nóng)林大學碩士學位論文??誘導ｐＲｅｄＥＴ?（ａｍｐ）上ｒｅｄ基因表達。３０°Ｃ震蕩培養(yǎng)４ｈ?ＯＤ６００達到０．５左右，按??上述方法制備ＢＷ２５１１３?ｐＲｅｄＥＴ?（ａｍｐ）?ＢＡＣ－ｓｐｎ感受態(tài)細胞，５０?ｕ?Ｌ感受態(tài)細??胞與２?ｙ?Ｌ的１５２片段混合進行電轉(zhuǎn)化，懸浮液涂布于含有２５?ｕｇ／ｍＬ四環(huán)素及??１００ｕｇ／ｍＬ安普霉素的ＬＢ平板上，３７°Ｃ過夜培養(yǎng)。挑取若干單克隆，進行ＰＣＲ??驗證，對可擴增出４．３?ｋｂ條帶的克隆提取ＢＡＣ質(zhì)粒進行測序，完成ＢＡＣ－ｓｐｎ－１５２??的構(gòu)建及確認。??＼??＇?一?ＢＡ——丨，??４?ＰＣＲ??ｈｍｌ?－？?／－ｈｍ２??ａａｃ（３）ＩＶ＾?＇－＾ｉｐ?＾－ｉｎｌ＇??％一?＼??ＢＡＣ－ｊｐｎ－１５２?Ｖ??％：二?１）??圖２－２含有基因簇的接合轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒ＢＡＣ－ｓ／？ｉ－１５２的構(gòu)建??Ｆｉｇ?２－２?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＢＡＣ－５／？ｗ－１５２??２．２．２１?ＢＡＣ－ｉ＾－１５２－ｒＡａ?的構(gòu)建??引物設計??根據(jù)ＮＣＢＩ可獲得�。⒅濉㈤_放閱讀框及上游序列信息，通過生物??信息學可分析其ＲＢＳ?（核糖體結(jié)合位點）及啟動子區(qū)域，由此設計３對引物分??別擴增含有吻、ｇＷＡｒｅ、ｇＭ的ＲＢＳ及編碼區(qū)片段。??正向序列?ｅｐｉ－Ｆ：?ＧＴＣＡＧＧＡＴＣＣ?４９４６０ＣＡＡＣＧＴＣＡＴＡＧＧＣＴＴＴＣＧＧＣ?（下??劃線堿基為限制性內(nèi)切酶ＢａｍＨＩ識別位點）??反向序列?ｅｐｉ－Ｒ：?ＧＴＣＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＴＣＡＧＣ?（下劃線堿??基為限制性內(nèi)切酶Ｘｂａｌ識別位點）??３２??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]多殺菌素高產(chǎn)菌株的選育[J]. 賀玉平,戴經(jīng)元,代鵬,胡西洲,林開春.  中國生物防治. 2006(01)
[2]多殺菌素生產(chǎn)菌株的選育[J]. 代鵬,徐雪蓮,賀玉平,戴經(jīng)元,林開春,黃俊生.  熱帶作物學報. 2005(04)
[3]多殺菌素的生物合成[J]. 蘇建亞,沈晉良.  中國生物工程雜志. 2003(05)

碩士論文
[1]多殺菌素產(chǎn)生菌菌種選育及原生質(zhì)體制備[D]. 程休.浙江大學 2006



本文編號：3097337