本文關(guān)鍵詞：爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp-33基因的克隆及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：根結(jié)線蟲(chóng)屬于固著性專性植物寄生線蟲(chóng),在侵染植物的過(guò)程中分泌多種與寄生相關(guān)的蛋白,稱之為效應(yīng)子蛋白。根結(jié)線蟲(chóng)的食道腺是合成效應(yīng)子蛋白的重要場(chǎng)所,其合成的效應(yīng)子蛋白往往具有N端信號(hào)肽,被分泌到食道中,最后通過(guò)口針注入植物體內(nèi)。研究這些效應(yīng)子蛋白的功能和作用,有助于人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)根結(jié)線蟲(chóng)與植物互作的分子機(jī)制,進(jìn)而為根結(jié)線蟲(chóng)的防治提供理論基礎(chǔ)。本論文根據(jù)南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne incognita)Mi-msp33基因的序列,利用同源克隆和RACE方法,從爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne javanica)中成功克隆了同源基因Mj-msp33,并獲得了Mj-msp33全長(zhǎng)cDNA序列。Mi-msp33基因片段的編碼序列只有N端部分333 bp,本文獲得的Mj-msp33基因的ORF全長(zhǎng)1326 bp,編碼一個(gè)442 aa的蛋白。Mj-msp33蛋白是一個(gè)新的爪哇根結(jié)線蟲(chóng)候選效應(yīng)子蛋白,具有N端信號(hào)肽和一個(gè)pat4:KKHK核定位信號(hào)(NLS)。利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì),除了Mi-msp33蛋白,未在其它線蟲(chóng)種類和其它物種上發(fā)現(xiàn)與之同源的蛋白。通過(guò)原位雜交(In-situ Hybridization)、齡期表達(dá)分析和酵母雙雜交(Yeast two-hybrid)等方法,對(duì)Mj-msp33基因的功能進(jìn)行了初步的鑒定。利用地高辛(Digoxin)標(biāo)記的特異性探針,進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,Mj-msp33在爪哇根結(jié)線蟲(chóng)侵染前二齡幼蟲(chóng)(pre-J2)的亞腹食道腺特異表達(dá)。齡期表達(dá)分析結(jié)果顯示,Mj-msp33在爪哇根結(jié)線蟲(chóng)侵染前二齡幼蟲(chóng)(pre-J2)和侵染早期階段(2dpi)表達(dá)量最高,以及在侵染后二齡幼蟲(chóng)(5dpi)表達(dá)量也比較高;此后隨著線蟲(chóng)的發(fā)育,Mj-msp33的表達(dá)量逐漸降低,成熟雌蟲(chóng)時(shí)期表達(dá)量最低。利用酵母雙雜交系統(tǒng),通過(guò)構(gòu)建爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp33的誘餌融合蛋白,進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),篩選到一個(gè)與Mj-msp33蛋白存在相互作用的擬南芥(Arabidopsis thaliana)蛋白,甘油磷酸二脂酶(Glycerophosphodiester phosphodiesterase,GDPD),擬南芥甘油磷酸二脂酶與細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和植物防御有關(guān)。根據(jù)本論文的研究結(jié)果,推測(cè)基因Mj-msp33可能對(duì)爪哇根結(jié)線蟲(chóng)的寄生有重要作用。
【關(guān)鍵詞】：爪哇根結(jié)線蟲(chóng) 基因克隆 Mj-msp33 效應(yīng)子蛋白
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S432.45
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-11
• 1 前言11-19
• 1.1 根結(jié)線蟲(chóng)的危害11-12
• 1.2 根結(jié)線蟲(chóng)的防治12-13
• 1.3 根結(jié)線蟲(chóng)效應(yīng)子蛋白的研究進(jìn)展13-17
• 1.3.1 改變植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)14
• 1.3.2 分子模擬寄主內(nèi)源信號(hào)14-15
• 1.3.3 抑制植物防御反應(yīng)15-16
• 1.3.4 調(diào)控寄主的轉(zhuǎn)錄16-17
• 1.3.5 轉(zhuǎn)錄后修飾17
• 1.3.6 未知功能的效應(yīng)子蛋白17
• 1.4 本研究的目的與意義17-19
• 2 材料與方法19-40
• 2.1 材料19-22
• 2.1.1 供試線蟲(chóng)種群與植株19
• 2.1.2 菌株與載體19
• 2.1.3 主要試劑與試劑盒19
• 2.1.4 主要溶液與培養(yǎng)基配方19-21
• 2.1.5 主要儀器與設(shè)備21
• 2.1.6 主要軟件與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)21-22
• 2.1.7 引物設(shè)計(jì)與合成22
• 2.2 方法22-40
• 2.2.1 供試番茄植株的培養(yǎng)22
• 2.2.2 供試線蟲(chóng)的培養(yǎng)與收集22
• 2.2.3 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)總RNA的提取22-23
• 2.2.4 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA23
• 2.2.5 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp33基因片段的同源克隆23-25
• 2.2.5.1 PCR擴(kuò)增Mj-msp33基因片段23-24
• 2.2.5.2 PCR產(chǎn)物的純化回收24-25
• 2.2.5.3 回收的PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體25
• 2.2.5.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選25
• 2.2.6 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp33基因全長(zhǎng)的獲得25-27
• 2.2.6.1 5' RACE-PCR25-26
• 2.2.6.2 3' RACE-PCR26-27
• 2.2.6.3 Mj-msp33基因全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增27
• 2.2.6.4 重組質(zhì)粒pMD18-T-Mj-msp33的提取27
• 2.2.7 Mj-msp33在爪哇根結(jié)線蟲(chóng)中的原位雜交分析27-30
• 2.2.7.1 原位雜交實(shí)驗(yàn)探針的制備27-29
• 2.2.7.2 線蟲(chóng)的固定及處理29
• 2.2.7.3 雜交實(shí)驗(yàn)29-30
• 2.2.8 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp33基因的齡期表達(dá)分析30-33
• 2.2.8.1 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)卵的收集30-31
• 2.2.8.2 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)侵染前二齡幼蟲(chóng)的收集31
• 2.2.8.3 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)侵染后2齡幼蟲(chóng)、3 齡幼蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)的收集31
• 2.2.8.4 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)成熟雌蟲(chóng)的收集31
• 2.2.8.5 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)各齡期總RNA的提取31
• 2.2.8.6 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)各齡期cDNA的獲得31-32
• 2.2.8.7 qRT-PCR分析Mj-msp33在爪哇根結(jié)線蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)水平32-33
• 2.2.9 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp33蛋白與擬南芥互作蛋白的初步鑒定33-40
• 2.2.9.1 誘餌載體pGBKT7-Mj-msp33的構(gòu)建33-34
• 2.2.9.2 酵母菌株AH109感受態(tài)的制備34-35
• 2.2.9.3 誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母菌株AH10935
• 2.2.9.4 誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109陽(yáng)性菌落的檢測(cè)35-36
• 2.2.9.5 誘餌載體毒性與自激活檢測(cè)36
• 2.2.9.6 酵母雙雜交文庫(kù)篩選36-37
• 2.2.9.7 酵母陽(yáng)性菌落的驗(yàn)證37-38
• 2.2.9.8 酵母質(zhì)粒的抽提38-39
• 2.2.9.9 酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α39
• 2.2.9.10 誘餌載體與篩選到的潛在互作因子的共轉(zhuǎn)化39-40
• 3 結(jié)果與分析40-54
• 3.1 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp33基因的克隆40-46
• 3.1.1 同源克隆40
• 3.1.2 RACE實(shí)驗(yàn)40-41
• 3.1.3 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp33基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增41-43
• 3.1.4 同源性分析43
• 3.1.5 理化性質(zhì)分析43-44
• 3.1.6 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp33蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)44-46
• 3.1.6.1 Mj-msp33蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)44-45
• 3.1.6.2 Mj-msp33蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)45
• 3.1.6.3 Mj-msp33蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)45-46
• 3.2 Mj-msp33在爪哇根結(jié)線蟲(chóng)中的表達(dá)定位分析46-48
• 3.2.1 探針的制備46-48
• 3.2.2 原位雜交實(shí)驗(yàn)48
• 3.3 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp33基因的齡期表達(dá)分析48-49
• 3.4 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp33蛋白與擬南芥互作蛋白的初步鑒定49-54
• 3.4.1 誘餌載體pGBKT7-Mj-msp33的構(gòu)建49-51
• 3.4.2 誘餌載體pGBKT7-Mj-msp33轉(zhuǎn)化酵母菌株AH10951-52
• 3.4.3 擬南芥互作蛋白的初步篩選52-53
• 3.4.4 誘餌蛋白與捕獲蛋白共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞53-54
• 4 結(jié)論與討論54-59
• 4.1 結(jié)論54
• 4.2 討論54-58
• 4.2.1 Mj-msp33基因全長(zhǎng)的獲得54-55
• 4.2.2 Mj-msp33蛋白是爪哇根結(jié)線蟲(chóng)分泌蛋白55
• 4.2.3 Mj-msp33蛋白定位在植物的細(xì)胞核55
• 4.2.4 磷酸化修飾55
• 4.2.5 Mj-msp33在爪哇根結(jié)線蟲(chóng)pre-J2的亞腹食道腺中特異表達(dá)55-56
• 4.2.6 Mj-msp33在爪哇根結(jié)線蟲(chóng)侵染前和侵染早期階段特異表達(dá)56
• 4.2.7 Mj-msp33蛋白與擬南芥GDPD蛋白存在互作關(guān)系56-58
• 4.3 本論文還需進(jìn)一步解決的問(wèn)題58-59
• 致謝59-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 附錄66-71

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp-33基因的克隆及功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：302700