為探明生防菌Br-2在分枝列當(dāng)體內(nèi)及番茄根圍的定殖能力,采用PEG-CaCl₂介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系將紅色熒光蛋白基因DsRed轉(zhuǎn)入到菌株Br-2中,并構(gòu)建其生長曲線,測定其對分枝列當(dāng)種子萌發(fā)的抑制率,通過共聚焦顯微鏡觀察其在分枝列當(dāng)莖內(nèi)及番茄根圍的定殖情況。結(jié)果表明:通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系得到了標(biāo)記菌株Br-2-DsRed,繼代培養(yǎng)5代后,其在共聚焦顯微鏡下仍可觀察到亮紅色熒光,經(jīng)PCR檢測帶有DsRed基因,證明其穩(wěn)定性好。標(biāo)記菌株Br-2-DsRed與野生菌株Br-2的生長曲線基本一致,對分枝列當(dāng)種子萌發(fā)的抑制率分別為75.86%和74.14%,無顯著差異。顯微觀察發(fā)現(xiàn),標(biāo)記菌株Br-2-DsRed接種1 d后即能夠侵染分枝列當(dāng)?shù)那o部表皮,3 d后主要分布在莖表皮和厚壁細(xì)胞間隙,5 d后侵染到厚壁細(xì)胞及維管束細(xì)胞內(nèi)部并導(dǎo)致莖部腐爛;而標(biāo)記菌株Br-2-DsRed不能侵染番茄根尖的內(nèi)部,主要定殖在番茄根尖表面。 

【文章來源】：植物保護(hù)學(xué)報(bào). 2017,44(04)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

紅色熒光蛋白標(biāo)記菌株Br-2-DsRed的穩(wěn)定性分析及驗(yàn)證Fig.1StabilityanalysisandverificationofBr-2-DsRedstainlabeledwithredfluorescentprotein

oteinA：Br-2-DsRed菌絲形態(tài)；B：Br-2-DsRed孢子形態(tài)；C：轉(zhuǎn)化子中DsRed的PCR檢測；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1~3：標(biāo)記菌株Br-2-DsRed基因組；4：質(zhì)粒PRHN1；5：野生菌株Br-2基因組。A：MorphologiesofBr-2-DsRedmycelium；B：morpholo-giesofBr-2-DsRedconidiogenouscells；C：detectionofDsRedgeneintransformantgenomesbyPCRamplification；M：DNAmarker；1-3：genomicDNAofBr-2-DsRed；4：plasmidPRHN1；5：genomicDNAofBr-2.2.2標(biāo)記菌株的生長曲線野生菌株Br-2和標(biāo)記菌株Br-2-DsRed的生長趨勢基本相同，生長曲線基本重合（圖2）。菌株在培養(yǎng)1~4d為分生孢子的對數(shù)生長期，5~9d為穩(wěn)定生長期，表明野生菌株Br-2進(jìn)行紅色熒光蛋白標(biāo)記后，外源質(zhì)粒PRHN1的存在和紅色熒光蛋白的表達(dá)對菌株Br-2的生長無明顯影響。圖2野生菌株Br-2和標(biāo)記菌株Br-2-DsRed的生長曲線Fig.2ThegrowthcurveofwildstainBr-2andlabeledstainBr-2-DsRed圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。Dataaremean±SD.2.3標(biāo)記菌株對分枝列當(dāng)種子萌發(fā)的影響將野生菌株Br-2和標(biāo)記菌株Br-2-DsRed孢子懸浮液加入到萌發(fā)培養(yǎng)的分枝列當(dāng)種子中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)菌株均能夠顯著抑制分枝列當(dāng)種子的萌發(fā)，萌發(fā)率分別為25.00%和23.33%，均顯著低于對照（表1）。野生菌株Br-2對分枝列當(dāng)種子萌發(fā)的抑制率為74.14%，標(biāo)記菌株Br-2-DsRed的抑制率為75.86%，二者間無顯著差異。表明野生菌株Br-2進(jìn)行紅色熒光蛋白標(biāo)記后，對分枝列當(dāng)種子的抑制作用并未受到不利影響。表1野生菌株Br-2和標(biāo)記菌株Br-2-DsRed對分枝列當(dāng)種子萌發(fā)的抑制作用Table1TheinhibitingeffectofBr-2andstainBr-2-DsRedongerminationofOrobancheaegyptiacaseed%菌株StrainBr-2Br-2-DsRed對照CK萌發(fā)率Sproutingrate25.00±2.

細(xì)胞和厚壁細(xì)胞間隙的標(biāo)記菌株Br-2-DsRed侵染到細(xì)胞內(nèi)部，維管束和薄壁細(xì)胞內(nèi)分布有大量的Br-2-DsRed菌株，并且細(xì)胞開始降解，且莖部細(xì)胞逐漸降解并出現(xiàn)腐爛狀態(tài)（圖3-D）。共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)記菌株Br-2-DsRed在番茄根尖的定殖情況發(fā)現(xiàn)，接種1~15d后Br-2-DsRed菌株在番茄根部的分布情況一致，主要分布在番茄根尖的表面，并不能侵染到根尖的內(nèi)部（圖4）。圖3共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)記菌株Br-2-DsRed在分枝列當(dāng)莖部的定殖情況Fig.3ColonizationimagesofBr-2-DsRedinOrobancheaegyptiacastembytheconfocalmicroscopeA：對照；B~D：接種1、3、5d后Br-2-DsRed菌株分布情況。A：Control；B-D：colonizationimagesofBr-2-DsRedafterin-oculationof1，3，5d.圖4標(biāo)記菌株Br-2-DsRed在番茄根尖的定殖情況Fig.4ColonizationimagesofBr-2-DsRedontomatoroottipbyconfocalmicroscopeA：對照；B：根表面；C：根內(nèi)部。A：Control；B：rootsurface；C：rootinternal.3討論生防微生物在植株中定殖、擴(kuò)散和生存競爭能力是評價(jià)其生防潛能的一個(gè)重要方面。而DsRed標(biāo)記技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)、原位研究微生物的空間定殖、微生物與環(huán)境及宿主的互作，在研究定殖規(guī)律方面具有良好的應(yīng)用前景（Sarroccoetal.，2007）。但是在對菌株進(jìn)行熒光標(biāo)記時(shí)，熒光基因的表達(dá)是在宿主菌668植物保護(hù)學(xué)報(bào)44卷

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3008038