本文關(guān)鍵詞：青枯勞爾氏菌EP-1胞外多糖合成缺陷突變體篩選及生物學(xué)特征研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum),又稱青枯菌,起初命名為青枯假單胞桿菌(Pseudomonas solanacearum),革蘭氏陰性菌,是一種土傳植物細(xì)菌性青枯病的病原菌。青枯菌環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、寄主范圍廣,可危害40多個(gè)科的數(shù)百種植物,嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害巨大。本實(shí)驗(yàn)利用廣東地區(qū)常見的強(qiáng)毒力青枯菌菌株EP-1構(gòu)建Tn5插入突變體庫,在24,500個(gè)克隆中篩選得到15個(gè)胞外多糖明顯減少的突變體,利用hiTAIL-PCR方法獲得突變基因的全序列,通過酶活生物測定、生物膜檢測、運(yùn)動(dòng)性檢測和接種試驗(yàn)分析突變體的表型與致病性,進(jìn)一步利用qRT-PCR技術(shù)分析相關(guān)基因表達(dá)量的差異,為進(jìn)一步研究青枯菌胞外多糖致病性及調(diào)控機(jī)理和構(gòu)建快速鑒定青枯菌致病力強(qiáng)弱的方法奠定基礎(chǔ)。結(jié)果如下:1.篩選得到的15個(gè)胞外多糖明顯減少的突變體,分別命名為Em2、Em3、Em4、Em28、Em29、Em31、Em32、Em36、Em37、Em51、Em56、Em58、Em60、Em61和Em64。另外,獲得青枯菌菌株EP-1、GMI1000、從番茄和花生分離得到的TM-1和PN-1菌株分別傳代培養(yǎng)至60代、25代和30代得到EP-60、GMI1000-25、TM-30和PN-30。2.通過hiTAIL-PCR方法確定突變體插入基因位點(diǎn)。比對分析表明,突變體Em2、Em3、Em4、Em29、Em31和Em37突變在相同基因phcA的不同位點(diǎn),該基因全長1044bp,編碼347個(gè)氨基酸,是青枯菌致病性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心調(diào)控因子;突變體Em28突變在基因epsB中,該基因全長2256bp,編碼751個(gè)氨基酸,位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游,與其胞外多糖的分泌密切相關(guān);突變體Em32突變在基因CMR15-30160中,該基因全長690bp,編碼229個(gè)氨基酸,具體功能未知;突變體Em36突變在基因gstO中,該基因全長690bp,編碼229個(gè)氨基酸,與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的合成有關(guān);突變體Em51突變在基因pstS2中,該基因全長1062bp,編碼353個(gè)氨基酸,可能與磷酸鹽結(jié)合的周質(zhì)前體ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的的合成有關(guān);突變體Em56突變在基因asd中,該基因全長1104bp,編碼367個(gè)氨基酸,可能與天冬氨酸半醛脫氫酶氧化還原有關(guān);突變體Em58突變在基因RSc1351中,該基因全長1245bp,編碼414個(gè)氨基酸,可能是組氨酸激酶跨膜轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白感受器;突變體Em60突變在基因RSc1584中,該基因全長441bp,編碼146個(gè)氨基酸,推測為假定轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子;突變體Em61突變在基因RSc1620中,該基因全長243bp,編碼80個(gè)氨基酸,是假定跨膜蛋白;突變體Em64突變在基因pckG中,該基因全長1869bp,編碼622個(gè)氨基酸,可能是磷酸羧化酶蛋白。3.通過qRT-PCR檢驗(yàn)分析表明,突變基因?qū)е翬P-1胞外多糖相關(guān)基因和編碼群體感應(yīng)信號(hào)基因phcB的表達(dá)量降低;接種寄主植物表明致病性減弱,還對運(yùn)動(dòng)性及生物膜的形成產(chǎn)生影響。4.初步建立了鑒定青枯菌致病力分化的檢測方法�；趯Φ玫降陌舛嗵呛铣扇毕萃蛔凅w的分析結(jié)果,或許可以選取基因phcA、gstO、RSc1351和RSc1584為靶標(biāo),通過分析基因表達(dá)量的變化,從而評估青枯菌菌株致病力強(qiáng)弱。
【關(guān)鍵詞】：青枯菌 Tn5突變體庫 胞外多糖 毒力因子 致病性
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S432.42
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮寫詞和英漢對照表7-11
• 1 前言11-17
• 1.1 青枯菌病害的概況11-12
• 1.1.1 青枯菌及其危害性11
• 1.1.2 青枯菌對植物的侵染過程11-12
• 1.2 青枯菌病害的研究進(jìn)展12-15
• 1.2.1 青枯菌的致病因子12-13
• 1.2.2 青枯菌致病性調(diào)控機(jī)理13-15
• 1.3 青枯菌中的群體感應(yīng)（QS）系統(tǒng)15
• 1.4 青枯菌基因組與致病性的關(guān)系15-16
• 1.5 青枯菌致病性強(qiáng)弱菌株鑒定方法研究進(jìn)展16-17
• 1.6 本研究的內(nèi)容、目的和意義17
• 2 材料與方法17-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備17-20
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒的來源17-18
• 2.1.2 主要試劑和其他材料18
• 2.1.3 培養(yǎng)基及溶液的配制18-19
• 2.1.4 主要儀器及設(shè)備19-20
• 2.2 EP-1 Tn5插入突變體庫的構(gòu)建20
• 2.2.1 雙親雜交20
• 2.2.2 突變體的篩選20
• 2.3 突變體轉(zhuǎn)座子插入檢驗(yàn)20-22
• 2.3.1 青枯菌特異性檢測20-21
• 2.3.2 Tn5轉(zhuǎn)座子插入檢測21-22
• 2.4 確定Tn5轉(zhuǎn)座子插入位置22-28
• 2.4.1 青枯菌基因組的提取22
• 2.4.2 hiTAIL-PCR擴(kuò)增獲得目的基因序列22-25
• 2.4.3 目的片段的回收25-26
• 2.4.4 PCR產(chǎn)物的連接反應(yīng)26
• 2.4.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α26-27
• 2.4.6 陽性重組轉(zhuǎn)化子的鑒定27
• 2.4.7 Tn5插入?yún)^(qū)側(cè)翼序列分析27-28
• 2.4.8 對目的基因進(jìn)行分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的鑒定與分析28
• 2.6 表型分析及生長曲線的測定28
• 2.6.1 纖維素酶檢測28
• 2.6.2 生物膜檢測28
• 2.6.3 運(yùn)動(dòng)性檢測28
• 2.6.4 生長曲線的測定28
• 2.7 致病性分析28-29
• 2.8 基因表達(dá)和調(diào)控分析29-32
• 2.8.1 細(xì)菌RNA的提取29-30
• 2.8.2 總RNA的純度和完整性檢測30
• 2.8.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30-31
• 2.8.4 qRT-PCR31-32
• 3 結(jié)果與分析32-45
• 3.1 EP-1 Tn5插入突變體庫的構(gòu)建32-33
• 3.1.1 雙親雜交獲得突變體32-33
• 3.1.2 突變體的篩選33
• 3.2 突變體插入檢測33-34
• 3.3 hiTAIL-PCR擴(kuò)增獲得目的基因序列34-40
• 3.3.1 hiTAIL-PCR產(chǎn)物的電泳檢測34
• 3.3.2 陽性重組轉(zhuǎn)化子的鑒定34-35
• 3.3.3 Tn5插入?yún)^(qū)側(cè)翼序列分析35-37
• 3.3.4 分子生物學(xué)和生物信息學(xué)分析37-40
• 3.4 表型分析及生長曲線的測定40-43
• 3.4.1 纖維素酶檢測40-41
• 3.4.2 生物膜檢測41
• 3.4.3 運(yùn)動(dòng)性檢測41-42
• 3.4.4 生長曲線的測定42-43
• 3.5 致病性分析43
• 3.6 基因表達(dá)和調(diào)控分析43-45
• 3.6.1 細(xì)菌RNA電泳檢測43-44
• 3.6.2 群體感應(yīng)基因表達(dá)量分析44
• 3.6.3 鑒定致病力分化菌株方法的探索44-45
• 4 結(jié)論與討論45-49
• 4.1 結(jié)論45-46
• 4.2 討論46-49
• 4.2.1 青枯菌胞外多糖突變及篩選體系的建立46-47
• 4.2.2 胞外多糖及其相關(guān)基因與青枯菌致病性的關(guān)系47
• 4.2.3 快速鑒定青枯菌致病力方法的構(gòu)建47-48
• 4.2.4 有待深入研究的內(nèi)容48-49
• 致謝49-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 附錄54-58

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號(hào)：298648