發(fā)布時間：2020-10-30 23:07

　　 ε-聚賴氨酸(ε-PL)是由微生物代謝產生的一種水溶性、可生物降解且具廣譜抗微生物活性的多肽類物質,其主要用于食品防腐劑上,但對植物病毒和植物病原真菌的抑制作用和機制尚未見報道,本文利用從細黃鏈霉菌遼寧致病變種中分離純化獲得的具有自主知識產權的ε-PL(發(fā)明專利受理號:201910330737.2)進行溫室盆栽、熒光檢測、Northern blot分析和透射電子顯微鏡觀察等試驗,研究了ε-PL對煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及機制;又通過平板抑菌試驗、離體葉接種試驗、孢子萌發(fā)抑制試驗和實時熒光定量PCR(qPCR)試驗,研究了ε-PL對植物真菌病害的防治作用及機理;通過對ε-PL處理后煙草BY-2細胞的RNA-Seq測序分析,研究了ε-PL對煙草植株抗病相關基因的誘導表達作用。以上研究為深入了解ε-PL對植物病毒和植物病原真菌的抑制作用及其機制提供了重要理論基礎。主要研究成果如下:1.ε-PL對TMV有明顯鈍化作用和預防效果。ε-PL在2000μg/ml濃度處理枯斑寄主心葉煙時,對TMV的鈍化抑制率和預防效果分別達到90.6%和79.3%,同濃度ε-PL處理系統(tǒng)侵染寄主普通煙NC89,對TMV的鈍化和預防效果分別為72.35%和56.7%;熒光檢測接種了轉綠色熒光蛋白(GFP)TMV的本氏煙苗,結果顯示無論是接種葉、上位葉還是頂葉的熒光斑點,藥劑處理組都較對照組明顯減少,其中100μg/mlε-PL處理的本氏煙的頂葉基本未見熒光斑點,而對照組頂葉綠色熒光區(qū)域明顯;Northern blot檢測分析了不同濃度ε-PL處理下接種TMV的煙葉和煙草BY-2原生質體,結果顯示ε-PL處理下樣品中TMV-RNA的量明顯減少,表明ε-PL影響了病毒核酸的合成和積累量;透射電子顯微鏡觀察結果表明,ε-PL可使病毒粒子發(fā)生斷裂、破損等現(xiàn)象。2.ε-PL對植物病原真菌具有顯著抑菌作用。用不同濃度的ε-PL對煙草赤星病菌、黃瓜褐斑病菌和水稻惡苗病菌進行平板抑菌試驗,結果顯示ε-PL對煙草赤星病菌和黃瓜褐斑病菌可以產生清晰明顯的抑菌圈,且ε-PL對煙草赤星病菌的最小抑菌濃度(MIC值)為5μg/ml,對黃瓜褐斑病菌的MIC值為10μg/ml,但ε-PL對水稻惡苗病菌的抑菌效果不顯著;離體葉接種試驗表明,ε-PL對煙草、黃瓜離體葉有明顯阻止病斑擴展的作用,且與對照相比,ε-PL對煙草赤星病斑擴展的阻止效果更為顯著;ε-PL對病菌菌絲生長的抑制試驗表明,200μg/mlε-PL處理3天時對煙草赤星病菌菌絲生長的抑制率達92%,處理7天的抑制率也高達87%左右,表明ε-PL穩(wěn)定性好,抑制作用強,可以長時間控制菌絲生長;ε-PL對病菌孢子萌發(fā)和芽管形態(tài)影響顯微觀測表明,當25μg/ml的ε-PL處理24h后,煙草赤星病菌孢子萌發(fā)產生的芽管會出現(xiàn)皺縮、畸形等變化;當濃度達到200μg/ml時,對孢子萌發(fā)的抑制率接近98%;ε-PL對煙草赤星病菌菌絲萌發(fā)及生長相關基因如環(huán)腺苷酸依賴性蛋白激酶A基因(PKA)、Alternaria alternata環(huán)腺苷酸依賴性蛋白激酶催化亞基(AAPK1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)和5.8s核糖體rRNA代表基因進行qPCR檢測,結果顯示前三個基因在ε-PL處理后發(fā)生顯著下調表達,從分子水平揭示了ε-PL對真菌抑制的作用機制。3.為了進一步了解ε-PL對寄主是否具有誘抗作用,利用ε-PL處理煙草BY-2細胞進行了轉錄組測序及功能分析。差異基因聚類分析結果表明,煙草熱休克同源蛋白70 kDa基因和與衰老相關蛋白等1350個基因表達量與對照相比顯著上調,而煙草花色素3-O-葡糖基轉移酶基因和煙草葉片表皮特異性分泌型糖蛋白等1700多基因與對照相比表達量發(fā)生顯著下調表達;差異基因Gene Ontology(GO)富集性分析顯示,ε-PL處理后煙草細胞顯著差異表達基因在生物學功能中主要富集于轉錄調控相關基因上,在細胞組分中主要富集于與細胞核、細胞質、質膜和膜的組成相關的基因上,在分子功能方面主要富集于與蛋白質結合相關、與轉錄相關或與有特殊序列的DNA結合功能相關的基因上,以上基因間接起到調控植物生長發(fā)育、進化和抗逆境等作用。差異基因Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集性分析顯示,差異基因主要富集于與植物熱反應相關,與毒素代謝相關,與氧化反應相關等重要通路上。綜上推測,ε-PL對煙草具有誘導抗病性作用。
【學位單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S432.41;S432.44
【部分圖文】：

圖 2-1 不同濃度 ε-PL 對普通煙上 TMV 的抑制效果 2-1 Inhibition effect of different concentrations of ε-PL on TMV on N. tabacum L. cv.

圖 2-2 500 μg/ml ε-PL 處理心葉煙上 TMV 的枯斑抑制效果Figure 2-2 Anti-TMV effect on N. glutinosa treated with 500 μg/ml ε-PL

圖 2-3 不同濃度 ε-PL 處理下接種 TMV 心葉煙的枯斑狀況Figure 2-3 Nocrotic lesions on N. glutinosa inoculated with TMV under differentconcentrations of ε-PL
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本文編號：2863124