二氯喹啉酸是由德國巴斯夫公司(BASF)開發(fā)的新型激素型除草劑,主要用于防除水稻田稗草及部分雙子葉雜草。因其具有用量少、持效期長、對稗草特效等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)。但由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,在田間降解緩慢,殘留時間長,給環(huán)境安全帶來潛在危害,并容易對后茬敏感作物產(chǎn)生殘留藥害,特別是在稻煙輪作區(qū),由于前茬稻田使用除草劑二氯喹啉酸,其在土壤中的殘留會導(dǎo)致后茬煙草產(chǎn)生嚴重的藥害,嚴重影響了烤煙的產(chǎn)量和質(zhì)量。本論文在此背景下,對二氯喹啉酸在土壤中的消解動態(tài)及其對后茬作物的藥害進行了研究；從受二氯喹啉酸藥害的煙草根系中分離出一株二氯喹啉酸內(nèi)生降解菌Q3,通過形態(tài)特征、生理生化特性研究及16S rDNA序列同源性分析對其進行了鑒定,并對其降解特性進行了研究；同時,采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)對二氯喹啉酸的微生物降解產(chǎn)物進行了分析鑒定,提出了其可能的降解途徑；通過室內(nèi)盆栽試驗及田間小區(qū)試驗初步研究了菌株Q3對煙草藥害的生物修復(fù)作用,探討了二氯喹啉酸脅迫下降解菌對煙草保護酶系活性的影響,為其田間應(yīng)用提供理論依據(jù)；對二氯喹啉酸內(nèi)生降解菌的全基因組DNA進行了測序,并對其全基因組進行了初步分析,為闡明巨大芽孢桿菌Q3降解二氯喹啉酸的分子機理提供了理論基礎(chǔ)。全文主要研究結(jié)果如下：采用優(yōu)化的QuEChERS方法對土壤中的二氯喹啉酸進行前處理,建立了二氯喹啉酸在土壤中殘留分析的高效液相色譜(HPLC)方法。當(dāng)土壤中二氯喹啉酸添加濃度為0.05～1.0mg/kg時,采用優(yōu)化的QuEChERS方法進行前處理的二氯喹啉酸添加回收率在90.17%-95.27%范圍內(nèi),相對標準偏差在1.94%3.22%之間,能滿足常規(guī)殘留分析的要求,同時,采用QuEChERS方法可以大量減少有機溶劑的使用,且操作步驟比較簡單,因而更適合用作二氯喹啉酸殘留檢測的常規(guī)前處理方法。采用配有紫外檢測器(UV Detector)的島津高效液相色譜儀(LC-20AT)對二氯喹啉酸的殘留進行檢測,發(fā)現(xiàn)低劑量(推薦劑量)下二氯喹啉酸的消解方程為Cx=0.984.e-0.024t,相關(guān)系數(shù)為0.9719,半衰期28.88 d；高劑量(2倍推薦劑量)下二氯喹啉酸的消解方程為Cx=1.5518.e-0.026t,相關(guān)系數(shù)為0.9905,半衰期為26.65 d。室內(nèi)生測結(jié)果表明,二氯喹啉酸對煙草藥害的主要癥狀表現(xiàn)為葉片扭曲畸形,在1mg/kg的濃度下煙草的生長完全停止并最終死亡。對其它幾種后茬作物藥害臨界濃度的測定結(jié)果表明：二氯喹啉酸對番茄、辣椒的藥害臨界濃度為104mg/L；對胡蘿卜、芹菜的藥害臨界濃度為10-5mg/L；對黃瓜的藥害臨界濃度為10-3mg/L。幾種作物對二氯喹啉酸的敏感程度從高到低依次為：胡蘿卜、芹菜、辣椒、番茄、黃瓜。由此可見,二氯喹啉酸對幾種作物的生長均存在不同程度的抑制作用,在進行水旱輪作時,應(yīng)根據(jù)二氯喹啉酸田間實際殘留濃度合理選擇輪作作物,減少除草劑殘留藥害的產(chǎn)生。采用無機鹽平板劃線法,從受二氯喹啉酸藥害脅迫的煙草根系分離得到一株對二氯喹啉酸具有較好降解效果的內(nèi)生降解菌,標記為Q3,Q3為革蘭氏陽性菌。通過形態(tài)學(xué)特性、生理生化特性分析、biolog鑒定以及16S rDNA序列同源性分析,最終將菌株Q3鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)。抗生素敏感性測試表明,該菌對青霉素及氨芐青霉素顯示抗性。研究了二氯喹啉酸起始濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH、接種量、搖床轉(zhuǎn)速以及降解時間等因素對菌株Q3生長及降解二氯喹啉酸效果的影響。結(jié)果表明：適合Q3生長及降解二氯喹啉酸的最佳條件為：二氯喹啉酸起始濃度20mg/L、培養(yǎng)溫度30℃C、pH 8.0、接種量6%、搖床轉(zhuǎn)速180 rpm,在最佳培養(yǎng)條件下,菌株Q3在降解第7d對二氯喹啉酸的降解效果可達93%。采用HPLC-MS/MS方法對二氯喹啉酸的微生物降解產(chǎn)物進行了分析鑒定。結(jié)果表明：在二氯喹啉酸的微生物降解過程中,共檢測到3種降解產(chǎn)物,分別為3,7-二氯-8-甲基喹啉、3-氯-8-羧酸喹啉、8一羧酸喹啉。通過降解產(chǎn)物推測菌株Q3對二氯喹啉酸的微生物降解途徑可能是通過羧基還原作用及脫氯作用進行的。采用室內(nèi)盆栽試驗及田間小區(qū)試驗,研究了二氯喹啉酸脅迫下內(nèi)生降解菌Q3對煙草藥害的修復(fù)效果,同時,分析了二氯喹啉酸脅迫下內(nèi)生降解菌Q3對煙草植株內(nèi)抗氧化酶等保護酶系(SOD、CAT、POD、APX等)活性以及MDA含量的影響。盆栽試驗結(jié)果表明：在移栽后30d,菌株Q3生物修復(fù)組(Quinclorac+Q3)的葉長、葉寬及株高恢復(fù)到了空白對照的89.49%、92.14%及93.64%；移栽后45d,分別恢復(fù)到了空白對照的93.40%、91.70%及92.29%。田間小區(qū)試驗結(jié)果表明：在菌株處理后11d,菌株Q3生物修復(fù)組(Quinclorac+Q3)的葉長、葉寬及株高恢復(fù)到了空白對照的90.49%、90.69%及88.95%；在菌株處理后22d,恢復(fù)到了空白對照的96.92%、93.83%及92.58%,盆栽試驗和田間小區(qū)試驗的結(jié)果均顯示Q3對煙草二氯喹啉酸藥害具有良好的恢復(fù)效果。對煙草抗氧化酶系活力測定的結(jié)果表明,在二氯喹啉酸脅迫下,內(nèi)生降解菌Q3還可以提高煙草植株內(nèi)保護酶系SOD、CAT、POD以及APX等酶的活性,并降低煙草植株內(nèi)MDA的含量,從而減輕二氯喹啉酸對煙草的藥害。采用第三代單分子實時測序系統(tǒng)PacBio RS平臺對Q3菌株進行了全基因組測序,得到了其全基因組序列。測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾后,采用HGAP軟件進行拼接,拼接序列進行反復(fù)校正,最終得到了Q3菌株的全基因組圖譜。Q3的全基因組由一個大小為5,153,539 bp的環(huán)狀染色體及一個大小為76,260 bp的環(huán)狀質(zhì)粒組成。染色體GC含量為38%。經(jīng)PROKKA軟件進行基因組注釋后,共預(yù)測得到5,264個編碼蛋白基因,172個RNA基因(包括130個tRNA基因和42個rRNA基因)。經(jīng)與其它報道的巨大芽孢桿菌的全基因組比較,發(fā)現(xiàn)在巨大芽孢桿菌Q3的全基因組中,共有4694個核心基因,294個泛基因,216個特異基因。Q3菌株中含有1個質(zhì)粒(Q3_p1),與菌株WSH-002中的質(zhì)粒WSH-002_p1 (NC_017139)同源,與WSH-002_p1質(zhì)粒相比,Q3_p1只有個基因BACMQ3_05432在WSH-002_p1中沒有相似序列,為其特有基因。質(zhì)粒Q3_p1中含有一套完整的rRNA基因集,還含有17個tRNA基因,組織結(jié)構(gòu)與chromosome類似。
【學(xué)位單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：X592;X172
【部分圖文】：

?湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)博±學(xué)位論文??．３二氯唾琳酸在止壤中的殘留消解動態(tài)??采用配有紫外檢測器（ＵＶ?Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）的島津高效液相色譜儀（ＬＣ－２０ＡＴ）對二晰酸在±壤中的殘留量進行檢測，液相色譜圖譜如圖２－４所示。從圖可Ｗ看出，唾晰酸的峰形較理想，對稱性良好，且雜質(zhì)去除較徹底，對二氯唾咐酸峰形干擾。??

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在室內(nèi)采用前巧施用二氯哇晰酸的水稻±進行盆栽試驗。煙苗于１２月３０日移栽，??在次年２月２日（即移栽后約３０ｄ）發(fā)現(xiàn)開始有明顯藥害癥狀出現(xiàn)，表現(xiàn)為必葉卷曲，??不能正常展開，但下部葉生長仍正常（圖２－６上右）。??ｒ?—?。＇主判?Ｐ?？?；＊’?＇■?＾??ｙ＇＾ｃＬｏｄ??圖２－６二氯睡嘟酸殘留對煙草的藥害癥狀??Ｆｉｇｕｒｅ?２－６?Ｐｈｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ?ｓｙｍｐｔｏｍ?ｏｆ?ｔｏｂａｃｃｏ?ｃａｕｓｅｄ?ｂｙ?ｑｕｉｎｃｌｏｒａｃ?ｒｅｓｉｄｕｅ??２３??
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本文編號：2845985