發(fā)布時(shí)間：2020-09-05 14:17

　　 土壤鹽堿化是限制作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫因素之一。甜菜作為世界上主要的糖料作物之一,具有較強(qiáng)的耐鹽堿性。研究甜菜的耐鹽堿機(jī)制,對(duì)鹽堿土的充分開發(fā)利用,推動(dòng)我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,具有重要意義。為探究甜菜對(duì)堿性鹽脅迫的適應(yīng)機(jī)制,本試驗(yàn)選用兩個(gè)耐性不同的甜菜品種KWS0143和Beta464作為供試材料,利用堿性鹽(摩爾比為2:1的NaHCO_3和Na_2CO_3的混合物)溶液進(jìn)行處理,對(duì)堿性鹽脅迫后兩個(gè)甜菜品種的生長指標(biāo)、光合特性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶、離子平衡、多胺和有機(jī)酸代謝進(jìn)行深入分析,結(jié)合細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,并通過對(duì)耐性較強(qiáng)的品種KWS0143進(jìn)行高通量測(cè)序,鑒定甜菜響應(yīng)堿性鹽脅迫的差異表達(dá)基因及l(fā)ncRNA與miRNA,從形態(tài)—解剖結(jié)構(gòu)—生理—分子等層面系統(tǒng)闡述了甜菜對(duì)堿性鹽脅迫的適應(yīng)性機(jī)制。所獲得的耐性相關(guān)基因可以豐富甜菜抗性基因資源庫,為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐鹽堿的甜菜新品種,進(jìn)一步挖掘甜菜耐鹽堿潛力提供理論依據(jù),對(duì)豐富甜菜學(xué)科理論具有重要意義。主要研究結(jié)果如下:(1)堿性鹽脅迫程度的加劇,導(dǎo)致甜菜幼苗凈光合速率、實(shí)際光化學(xué)效率、光合色素含量、植株干物質(zhì)重和根系形態(tài)指標(biāo)的顯著下降。堿性鹽脅迫導(dǎo)致甜菜葉片凈光合速率的降低是非氣孔因素造成的。75 mM堿處理使兩個(gè)品種的葉綠體均有所變長,基質(zhì)片層變得松散,嗜鋨滴數(shù)增加。Beta464的光合能力、干物質(zhì)積累和根系形態(tài)指標(biāo)等在堿性鹽脅迫下的受抑制程度比KWS0143嚴(yán)重。根冠比的變化可能也是甜菜適應(yīng)堿性鹽脅迫的一種方式。(2)堿性鹽脅迫下Beta464葉片和根系的生物膜受損傷比KWS0143嚴(yán)重,兩個(gè)甜菜品種的葉片的膜脂過氧化程度比根系嚴(yán)重。在脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖三種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中,脯氨酸含量在堿性鹽脅迫下上升幅度最大,可能在甜菜適應(yīng)堿性鹽脅迫過程中發(fā)揮的作用更大。在響應(yīng)堿性鹽脅迫過程中,兩個(gè)甜菜品種根系的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性強(qiáng)于葉片,說明根系的抗氧化能力可能強(qiáng)于葉片。KWS0143在堿性鹽脅迫下的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力總體強(qiáng)于Beta464。(3)隨著堿性鹽脅迫程度的加劇,甜菜葉片和根系中Na~+含量的增加使得K~+、Ca~(2+)不斷減少。甜菜可通過葉片向外分泌Na~+離子緩解Na~+毒害。在響應(yīng)堿性鹽脅迫過程中,KWS0143的K~+、Na~+選擇性運(yùn)輸系數(shù)提高,根系對(duì)Na~+的區(qū)域化作用加強(qiáng)。KWS0143較Beta464具有更強(qiáng)的維持Na~+、K~+、Ca~(2+)離子平衡的能力。(4)游離態(tài)腐胺(Put)、精胺(Spm)和亞精胺(Spd)參與了甜菜對(duì)堿性鹽脅迫的響應(yīng),堿性鹽脅迫下三種游離態(tài)多胺含量的上升,也刺激了多胺氧化酶和二胺氧化酶活性的增強(qiáng)。在三種游離態(tài)多胺中,Spd在堿性鹽脅迫下含量最高,上升幅度最大,可能在適應(yīng)堿性鹽脅迫中起主要作用。堿性鹽脅迫不斷加重后,KWS0143葉片和根系的游離態(tài)Spm含量均高于Beta464。甜菜根系和葉片的三種游離態(tài)多胺含量與脯氨酸、可溶性糖含量及POD活性等呈顯著的正相關(guān),說明堿性鹽脅迫下游離態(tài)多胺可能促進(jìn)了脯氨酸等滲透物質(zhì)的合成,增強(qiáng)了POD等抗氧化酶的活性。(5)堿性鹽脅迫下甜菜可通過增強(qiáng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性推動(dòng)三羧酸循環(huán)的進(jìn)行,促進(jìn)有機(jī)酸合成,以緩解堿性鹽脅迫帶來的pH傷害。在酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸6種有機(jī)酸中,酒石酸可能在甜菜抵御pH脅迫方面起的作用更大。甜菜也可通過根系分泌酒石酸、蘋果酸和乙酸參與根外pH的調(diào)節(jié)。堿性鹽脅迫較重時(shí),KWS0143的蘋果酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸含量高于Beta464,而酒石酸和乳酸的含量低于Beta464。(6)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明,在短時(shí)間和長時(shí)間的堿處理下,分別有573和261個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá),403和122個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá),其中有52個(gè)共同的上調(diào)表達(dá)基因和30個(gè)共同的下調(diào)表達(dá)基因在短時(shí)間和長時(shí)間的堿性鹽脅迫下均被鑒定了出來。在短時(shí)間堿性鹽脅迫下,D-3-磷酸甘油酸脫氫酶1基因LOC104901403、亞油酸鹽13S-脂氧合酶2-1基因LOC104889933和2-氧異戊酸脫氫酶α亞基1基因LOC104895418、脂肪酸過氧化氫裂合酶基因LOC104901567和乙烯利非敏感蛋白2基因LOC104884677均顯著上調(diào)表達(dá),谷氨酰-tRNA還原酶1基因LOC104905095顯著下調(diào);而在長時(shí)間的堿性鹽脅迫下,金屬耐性蛋白11基因LOC104886952顯著上調(diào),谷氨酰-tRNA還原酶1基因LOC104905095和ω-6脂肪酸去飽和酶基因LOC104900797顯著下調(diào)�？勺兗羟蟹治霰砻�,在短時(shí)間和長時(shí)間的堿性鹽脅迫處理下分別有8和16個(gè)差異表達(dá)基因發(fā)生了可變剪切。堿性鹽脅迫后甜菜差異表達(dá)基因發(fā)生的可變剪切的主要類型是:可變3′端剪切位點(diǎn)和外顯子跳躍。(7)高通量測(cè)序鑒定出8535個(gè)lncRNA。lncRNA的長度為201-12882 nt,平均長度為424nt。LNC_003498和LNC_003048均被預(yù)測(cè)為gma-miR4995的前體,而LNC_003418被預(yù)測(cè)為hbr-miR6173的前體。在短時(shí)間和長時(shí)間的堿性鹽脅迫下分別有54和37個(gè)lncRNA表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。對(duì)這些差異表達(dá)lncRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)了一些可能與甜菜逆境響應(yīng)相關(guān)的lncRNA及靶基因。LNC_001910的靶基因LOC104902979參與控制超氧化物歧化酶的合成,LNC_007731與編碼過氧化物酶的基因LOC104906740存在共表達(dá)現(xiàn)象,LNC_000160及其靶基因LOC104888423(水楊酸誘導(dǎo)蛋白同系物)均在短時(shí)間堿處理下顯著上調(diào)表達(dá),LNC_000365與上調(diào)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因LOC104892091共表達(dá)。(8)本文鑒定出甜菜的268個(gè)已知miRNA,并預(yù)測(cè)出61個(gè)novel miRNA。96個(gè)已知miRNA和45個(gè)novel miRNA在堿處理后差異表達(dá),例如osa-miR166m、lus-miR159b、gma-miR168b和novel_25。對(duì)堿性鹽脅迫響應(yīng)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析,最終發(fā)現(xiàn)67個(gè)堿性鹽脅迫響應(yīng)miRNA可能作用于45個(gè)基因。對(duì)差異表達(dá)miRNA靶基因的GO分析表明,差異表達(dá)miRNA的大量靶基因富集在“氧化還原過程”,如多酚氧化酶基因LOC104900758。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S156.4;S566.3
【部分圖文】：

本研究的技術(shù)路線

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)博士學(xué)位論文.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析利用 Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與圖表制作，利用 SPSS 20.0 采用 LSD 法進(jìn)行方差分析和比較。.3 RNA 測(cè)序試驗(yàn).3.1 甜菜響應(yīng)堿性鹽脅迫的基因的發(fā)現(xiàn)與分析3.1.1 堿性鹽處理及取樣處理前的幼苗培養(yǎng)條件同 2.2.1。

圖 2-2 lncRNA 篩選流程圖Fig. 2-2 Screening process of lncRNAs.3.2 甜菜響應(yīng)堿性鹽脅迫的 lncRNA 的發(fā)現(xiàn)與分析3.2.1 堿性鹽處理及取樣同 2.3.1.1。3.2.2 RNA 提取、文庫構(gòu)建及 RNA 測(cè)序同 2.3.1.2。3.2.3 lncRNA 的篩選與堿性鹽脅迫響應(yīng) lncRNA 的鑒定lncRNA 的篩選流程見圖 2-2。在進(jìn)行篩選之前，我們首先使用 Cuffmerge 軟件，對(duì)各樣接得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行合并，并去掉其中鏈方向不確定的轉(zhuǎn)錄本，得到本次測(cè)序完整的轉(zhuǎn)錄息。之后，對(duì)合并的轉(zhuǎn)錄本集合進(jìn)行 lncRNA 的篩選，主要步驟如下：（1）轉(zhuǎn)錄本 exon 個(gè)數(shù)篩選：過濾轉(zhuǎn)錄本拼接結(jié)果中大量低表達(dá)量，低可信度的單外顯錄本，選擇 exon 個(gè)數(shù)≥ 2 的轉(zhuǎn)錄本（植物篩選會(huì)加入單外顯子轉(zhuǎn)錄本）；（2）轉(zhuǎn)錄本長度篩選：選擇轉(zhuǎn)錄本長度> 200bp 的轉(zhuǎn)錄本；

本文編號(hào)：2813121