三唑類和嘧啶醇類殺菌劑作為兩種廣泛使用的手性殺菌劑,目前已在多種環(huán)境介質(zhì)中檢測(cè)到殘留超標(biāo),生態(tài)安全事故頻發(fā)。然而關(guān)于人CYP3A4酶介導(dǎo)的三唑類和嘧啶醇類殺菌劑立體選擇性代謝研究匱乏,分子作用機(jī)制亦不明確。本文選取葉菌唑、氯/氟苯嘧啶醇為目標(biāo)化合物,分離制備了對(duì)映體,進(jìn)行了關(guān)于CYP3A4酶介導(dǎo)代謝的立體選擇性研究,從與CYP3A4酶相互作用角度,詮釋了這兩類殺菌劑的代謝立體選擇差異性的分子機(jī)制。主要獲取的結(jié)果和結(jié)論如下：(1)采用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)成功分離和制備了葉菌唑四個(gè)單一手性異構(gòu)體,并利用圓二色光譜儀(Circular Dichroism, CD)和含時(shí)密度泛函理論(Time-dependent Density Functional Theory,TDDFT)鑒定了各對(duì)映體的絕對(duì)化學(xué)構(gòu)型。(2)選取葉菌唑cis-RS和cis-SR兩種單體,研究了人肝微粒體(Human Liver Microsome, HLM)和CYP3A4酶介導(dǎo)的代謝的立體選擇性差異,發(fā)現(xiàn)葉菌唑能被HLM和CYP3A4酶降解,其中,CYP3A4酶為葉菌唑的主要代謝酶,其對(duì)葉菌唑的降解率遵循cis-RScis-SR.代謝過(guò)程中,對(duì)映體分?jǐn)?shù)(Enantiomer Fraction, EF)由0.5逐漸增大到0.82,表明cis-RS能優(yōu)先被CYP3A4酶代謝,存在顯著的對(duì)映體選擇性差異。(3)針對(duì)氯/氟苯嘧啶醇進(jìn)行了人CYP3A4酶介導(dǎo)的體外代謝研究,發(fā)現(xiàn)氯苯嘧啶醇和氟苯嘧啶醇均能被CYP3A4酶代謝。氟苯嘧啶醇代謝速率大于氯苯嘧啶醇。氯苯嘧啶醇降解率與時(shí)間不成規(guī)律性變化,代謝無(wú)明顯對(duì)映體差異；氟苯嘧啶醇代謝具有一定立體選擇性差異,R型-氟苯嘧啶醇能優(yōu)先被CYP3A4酶降解,并且代謝具有顯著時(shí)間依賴性。(4)采用CYP3A4 Glo熒光素酶檢測(cè)技術(shù)分析了葉菌唑單體對(duì)人CYP3A4酶的活性影響。通過(guò)熒光光譜技術(shù)在分子水平上研究了葉菌唑?qū)τ丑w單體與人CYP3A4酶結(jié)合后誘導(dǎo)的CYP3A4酶的構(gòu)象變化,比較了不同單體結(jié)合力強(qiáng)弱。從相互作用角度分析了CYP3A4酶介導(dǎo)的葉菌唑的立體選擇性代謝差異。葉菌唑是CYP3A4酶的強(qiáng)抑制劑,抑制效果具有濃度依賴性并遵循cis-SRcis-RS。葉菌唑?qū)τ丑wcis-RS和cis-SR與CYP3A4酶結(jié)合模式各異,對(duì)CYP3A4蛋白結(jié)構(gòu)微環(huán)境產(chǎn)生的影響不同,可能引起蛋白功能破壞程度的差異。(5)從分子間相互作用角度分析了氯/氟苯嘧啶醇與CYP3A4酶的作用機(jī)制。酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)氯/氟苯嘧啶醇是CYP3A4酶的抑制劑,抑制效果遵循S-氟苯嘧啶醇R-氯苯嘧啶醇S-氯苯嘧啶醇R-氟苯嘧啶醇。熒光光譜法結(jié)合分子對(duì)接證實(shí)了氯/氟苯嘧啶醇會(huì)導(dǎo)致CYP3A4酶微觀結(jié)構(gòu)的改變。氯/氟苯嘧啶醇對(duì)映體與CYP3A4酶的相互作用力主要為氫鍵和范德華力,但作用強(qiáng)度有所差異,順序分別為R-氯苯嘧啶醇S-氯苯嘧啶醇和S-氟苯嘧啶醇R-氟苯嘧啶醇。(6)通過(guò)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)(Yeast Two-hybrid Assay)發(fā)現(xiàn)葉菌唑和氯/氟苯嘧啶醇對(duì)雄激素受體(Androgen Receptor, AR)均具有拮抗作用。葉菌唑的兩個(gè)對(duì)映體ds-RS和cis-SR經(jīng)人CYP3A4酶代謝后,代謝產(chǎn)物對(duì)人AR受體拮抗效應(yīng)差別顯著,cis-SR呈現(xiàn)代謝活化,而cis-RS表現(xiàn)為代謝減毒。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：X592
【部分圖文】：

生物活化和毒性降解等起著至關(guān)重要的作用。至今，人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的Ｐ４５０酶約有逡逑５０邋種，主要包括邋ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４邋等。逡逑其中ＣＹＰ３Ａ４酶占人肝臟和小腸中的Ｐ４５０酶的３０％左右（圖１．３），是機(jī)體最重要逡逑Ｐ４５０酶。ＣＹＰ３Ａ４酶不僅能對(duì)內(nèi)源性底物，如類固醇．脂肪酸等進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，逡逑也是許多外源性化學(xué)物質(zhì)和藥物的結(jié)合受體，重要的藥物代謝酶，臨床上約有５０％逡逑的藥物靠它代謝。逡逑ＣＹＰ邋３Ａ４逡逑３４，４％逡逑巧逡逑圖１．３人體肝內(nèi)Ｐ４５０酶的組成逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｔｈｅ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｐ４５０邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｉｎ邋ｈｕｍａｎ邋ｌｉｖｅｒ逡逑１．３．２邋ＣＹＰ３Ａ４酶與污染物的相互作用逡逑目前關(guān)于Ｐ４５０酶與污染物的相互作用研究曰益增多。陳景文等通過(guò)密度泛函逡逑理論研究了關(guān)于ＣＹＰ４５０酶對(duì)ＢＤＥ－４７代謝的毒性機(jī)理和怲徑，建立計(jì)算方法ＬN(yùn)B預(yù)逡逑測(cè)參與污染物代謝轉(zhuǎn)化的主要ＣＹＰ酶１Ｗ。呂酷等選取鼠ＣＹＰ２Ｂ１對(duì)；種手性ＰＣＢ逡逑進(jìn)行了對(duì)映體水平上的代謝研究，發(fā)現(xiàn)Ｓ－ＰＣＢ邋４５和＜Ｓ－ＰＣＢ邋％可Ｗ被優(yōu)先降解，逡逑代謝呈現(xiàn)立體差異，而ＰＣＢ邋１３２代謝則不存在對(duì)映體差異ＩＷ］。許多Ｓ唾類抗真菌逡逑藥如l#康唾、伊曲康唾等是ＣＹＰ３Ａ４的強(qiáng)抑制劑，通過(guò)與酶分子直接結(jié)合Ｌ義抑制逡逑ＣＹＰ３Ａ４的酶活性

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．４邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋Ｐ４５０邋Ｇｌｏ？邋Ａｓｓａｙ逡逑光譜逡逑學(xué)是利用生物大分子本身自帶的巧光發(fā)色團(tuán)（巧源巧光探的巧光發(fā)色團(tuán)（外源巧光探針），結(jié)合各種相關(guān)的巧光分析、功能及交互作用等信息，廣泛應(yīng)用于小分子化合物與蛋白用研究。如Ｗｉｌｌｉａｍ等人曾經(jīng)采用巧光分析技術(shù)對(duì)疏水性酶的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合常數(shù)等進(jìn)行探究ｉｎｉ。污染物通過(guò)氯鍵、華力等非共價(jià)結(jié)合力與蛋白結(jié)合后可能引起巧光光譜的變和偏振度的改變、特征吸收峰的位移、新巧光峰的出現(xiàn)等，巧光生色基團(tuán)所處微環(huán)境的變化情況，并獲得小分子化合物的相關(guān)參數(shù)和信息。逡逑

檢測(cè)劑逡逑？逡逑圖１．４Ｐ４５０Ｇ１Ｏ？檢測(cè)原理圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．４邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋Ｐ４５０邋Ｇｌｏ？邋Ａｓｓａｙ逡逑１．４．３巧光光譜逡逑巧光光譜學(xué)是利用生物大分子本身自帶的巧光發(fā)色團(tuán)（巧源巧光探針）或通逡逑過(guò)外來(lái)標(biāo)記的巧光發(fā)色團(tuán)（外源巧光探針），結(jié)合各種相關(guān)的巧光分析技術(shù)來(lái)收逡逑集分子結(jié)構(gòu)、功能及交互作用等信息，廣泛應(yīng)用于小分子化合物與蛋白質(zhì)等生物逡逑大分子相互作用研究。如Ｗｉｌｌｉａｍ等人曾經(jīng)采用巧光分析技術(shù)對(duì)疏水性探針ＴＮＳ逡逑和ＣＹＰ３Ａ４酶的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合常數(shù)等進(jìn)行探究ｉｎｉ。污染物通過(guò)氯鍵、疏水、靜逡逑電作用或范德華力等非共價(jià)結(jié)合力與蛋白結(jié)合后可能引起巧光光譜的變化，如巧逡逑光福射強(qiáng)度和偏振度的改變、特征吸收峰的位移、新巧光峰的出現(xiàn)等，從而了解逡逑蛋白分子中巧光生色基團(tuán)所處微環(huán)境的變化情況，并獲得小分子化合物與生物大逡逑分子結(jié)合機(jī)制的相關(guān)參數(shù)和信息。逡逑１．５課題研究目的、巧容與意義逡逑１．５．１課題研究目的逡逑通過(guò)體外代謝實(shí)驗(yàn)并結(jié)合巧光光譜、分子模擬等方法分析ＣＹＰ３Ａ４酶介導(dǎo)的逡逑葉菌噸和氯／l#《喃巧醇代謝的對(duì)映體選擇性差異，同時(shí)考察配體與人ＣＹＰ３Ａ４酶邐—逡逑的結(jié)合模式，了解配體的結(jié)合對(duì)人ＣＹＰ３Ａ４酶構(gòu)象的具體影響，進(jìn)一步從ＣＹＰ３Ａ４逡逑１１逡

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本文編號(hào)：2812331