發(fā)布時(shí)間：2020-08-31 09:54

　　 黃瓜細(xì)菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)和黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是危害葫蘆科作物的兩種常見病原物;李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李痘病毒(Plum pox virus,PPV)是核果類果樹的重要病原物。其中,黃瓜綠斑駁花葉病毒、李屬壞死環(huán)斑病毒、李痘病毒是我國(guó)出入境檢疫性有害生物。隨著國(guó)內(nèi)、國(guó)際貿(mào)易的迅猛發(fā)展,檢疫性病原物進(jìn)入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)逐漸提高。基于此,本研究針對(duì)上述四種病原物,利用交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)和重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立了快速準(zhǔn)確的病原物檢測(cè)方法,主要結(jié)果如下:1.建立黃瓜細(xì)菌性角斑病菌交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)根據(jù)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因,設(shè)計(jì)并篩選特異性引物,建立了黃瓜細(xì)菌性角斑病菌交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù),可區(qū)分黃瓜細(xì)菌性角斑病菌和13種常見的假單胞及其他菌屬致病菌,檢測(cè)限為0.54×10~3 CFU/mL。2.建立黃瓜綠斑駁花葉病毒交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)根據(jù)黃瓜綠斑駁花葉病毒基因組中3'端外殼蛋白基因序列,設(shè)計(jì)并篩選特異性引物,建立了黃瓜綠斑駁花葉病毒交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù),可區(qū)分黃瓜綠斑駁花葉病毒和其他5種葫蘆科作物常見病毒(黃瓜花葉病毒、辣椒輕斑駁病毒、煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、小西葫蘆黃花葉病毒),檢測(cè)限為24.3 ng/μL總RNA。3.建立李屬壞死環(huán)斑病毒交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)根據(jù)李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因序列,設(shè)計(jì)并篩選特異性引物,建立了李屬壞死環(huán)斑病毒交叉引物恒溫?cái)U(kuò)展檢測(cè)技術(shù),可區(qū)分李屬壞死環(huán)斑病毒和李屬植物的其他常見病毒(李痘病毒、蘋果花葉病毒、南芥菜花葉病毒)及類病毒(蘋果銹果類病毒、桃潛隱花葉類病毒),檢測(cè)限為72個(gè)拷貝。4.建立李痘病毒重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)根據(jù)李痘病毒全基因組中外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)并篩選特異性引物,建立了李痘病毒重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù),可以區(qū)分李痘病毒與其他3種馬鈴薯Y屬病毒(馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、小西葫蘆黃花葉病毒),以及常見的李屬植物病毒(李屬壞死環(huán)斑病毒、蘋果花葉病毒、南芥菜花葉病毒)與類病毒(蘋果銹果類病毒、桃潛隱花葉類病毒),檢測(cè)限為0.53 ng/μL總RNA。本研究基于兩種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),分別建立四種重要病原物的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)。這些檢測(cè)方法可以在恒溫條件下完成對(duì)目的核酸片段的擴(kuò)增,具有快速、特異、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),避免了常規(guī)檢測(cè)方法需要昂貴儀器、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn),在口岸檢疫和田間檢測(cè)中具有重要應(yīng)用價(jià)值,對(duì)于保護(hù)葫蘆科和李屬作物的生產(chǎn)具有重要意義。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S432.4
【部分圖文】：

第一章 引 言1.1 病原物概述1.1.1 黃瓜細(xì)菌性角斑病菌黃瓜細(xì)菌性角斑病病原菌為丁香假單胞黃瓜致病變種（Pseudomonas syringae pv.Lachrymans）(Olczakwoltman et al., 2007)。黃瓜細(xì)菌性角斑病菌基因組大小約為 6.5 Mb，包含一個(gè)環(huán)狀的染色體 DNA 和兩個(gè)單獨(dú)的質(zhì)粒 DNA(Buell et al., 2003)。該病菌為革蘭氏陰性菌，具有單極生鞭毛，菌體呈短桿狀，不耐酸，生長(zhǎng)溫度喜 25-28℃，濕度喜 75%以上，最適酸堿度為 PH6.8(劉延英, 2003)。黃瓜細(xì)菌性角斑病是黃瓜生產(chǎn)上的重要病害之一，分布廣且為害嚴(yán)重，在世界各地均有發(fā)生(孫福在 et al., 1988; 張吉光 et al., 2010)。黃瓜細(xì)菌性角斑病菌可通過灌水、氣流、風(fēng)雨，昆蟲和農(nóng)事操作等由氣孔、傷口侵入寄主。種植密度過大時(shí)，農(nóng)事操作易使葉片摩擦造成傷口，因此，在溫暖多雨條件下的連作田極易發(fā)病(李寶棟 2001)。染病初期的植株葉片呈現(xiàn)黃色褪綠斑點(diǎn)，葉背病斑為水浸狀，染病后期在葉脈阻隔下病斑呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形(圖 1.1)，之后病斑開裂，葉片干枯脫落(劉春艷 et al., 2010)。黃瓜細(xì)菌性角斑病菌癥狀與黃瓜霜霉病癥狀相似，在防治過程中極易混淆(蔡江文 et al., 2008; 王平 et al., 2012)。

論文 ，之后變成花葉，葉片凹凸不平，卷曲，并帶有濃綠色的（圖 1.2）。侵染后的西瓜種苗，果實(shí)表面有濃綠色圓斑，果浸狀，種子周圍果肉呈紫紅色水浸裝，果肉中黃色纖維明顯品質(zhì)下降，幾乎不能食用，同時(shí)產(chǎn)量嚴(yán)重下降，對(duì)瓜類作物V 隨著進(jìn)口瓜類種子傳入我國(guó)，使得多個(gè)地區(qū)的葫蘆科作綠斑駁花葉病毒主要通過種子進(jìn)行傳播，其他受污染的農(nóng)具瓜綠斑駁花葉病毒活力穩(wěn)定，移栽，授粉等農(nóng)事操作均可造有效的途徑是進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，切斷傳染源(鄭麗嬌 2010)。

圖 1.3 PNRSV 侵染玫瑰癥狀Fig. 1.3 Symptom of rose leaves infected by PNRSV(Salarejczak et al., 2005)毒Plum pox virus, PPV）屬于馬鈴薯 Y 病毒屬（Potyvirus），病毒粒子呈彎11 nm，病毒基因組含有一條單鏈 RNA，約 10,000 個(gè)寡核苷酸(Maiss2008)。李痘病毒是核果類果樹的重要危害病毒之一，可侵染杏、桃、其侵染的果樹葉片扭曲，出現(xiàn)褪綠環(huán)斑，葉脈黃化，果皮上出現(xiàn)環(huán)斑果實(shí)未成熟的時(shí)候大量脫落，產(chǎn)量降低，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(洪健 et 8)。自然條件下，李痘病毒會(huì)經(jīng)蚜蟲進(jìn)行傳播，染病繁殖材料的運(yùn)輸是原因(Wallis et al., 2005; 楊雷亮 et al., 2008)。李痘病毒目前在歐洲，

【參考文獻(xiàn)】

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1 曹冬梅;李鑫;孫曉菲;張寅寅;曹際娟;;黃瓜綠斑駁花葉病毒熒光納米顆粒試紙條的研制[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年09期

2 秦子禹;孫建設(shè);王娜;邵建柱;;一種高效的蘋果莖溝病毒(ASGV)TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)檢測(cè)方法[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2015年06期

3 鐘響;劉寧;尹偉力;耿金培;粟智平;段效輝;;食品中沙門氏菌的NASBA快速檢測(cè)技術(shù)[J];食品研究與開發(fā);2013年23期

4 祁軍;張霞;蔣剛強(qiáng);蔡國(guó)瑞;董亞學(xué);鄭文杰;;交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)志賀氏菌[J];食品研究與開發(fā);2013年11期

5 張靚;田茜;劉鳳權(quán);朱水芳;趙文軍;;六種重要瓜類種傳細(xì)菌可視基因芯片篩查方法研究[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2013年01期

6 陳傳;凌霄;郭震;邵筱;張如勝;魏泉德;;LAMP技術(shù)用于霍亂弧菌檢測(cè)的研究[J];生命科學(xué)研究;2012年05期

7 王平;樊金娟;劉長(zhǎng)遠(yuǎn);趙奎華;梁春浩;;黃瓜細(xì)菌性角斑病的分子檢測(cè)[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2012年25期

8 王哲;陳青;田茜;李志紅;朱水芳;趙文軍;;應(yīng)用PCR方法快速檢測(cè)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌[J];植物檢疫;2011年06期

9 孫艷秋;趙奎華;曹遠(yuǎn)銀;劉長(zhǎng)遠(yuǎn);梁春浩;;黃瓜細(xì)菌性角斑病免疫膠體金檢測(cè)試紙條的研制[J];植物病理學(xué)報(bào);2011年02期

10 王小明;王健華;馮團(tuán)誠(chéng);張雨良;吳育鵬;劉志昕;;黃瓜花葉病毒NASBA檢測(cè)技術(shù)的建立[J];植物病理學(xué)報(bào);2011年02期

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1 王春仁;牛羊仰口線蟲PCR-RFLP鑒別方法的建立及線粒體全基因組序列分析[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 崔紅光;李屬壞死環(huán)斑病毒遺傳多樣性分析和致病相關(guān)基因鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

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1 曹雪鋒;5種出血熱病毒RPA檢測(cè)方法的建立及其假病毒陽性參考品的制備[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2017年

2 張文明;辣椒輕斑駁病毒快速檢測(cè)技術(shù)研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2808644