【摘要】：化學防治一直是保護現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)免遭有害生物侵襲的主要方法,而有害生物抗藥性也給化學防治帶來巨大的挑戰(zhàn)。目前,世界上抗藥性問題最突出的有害生物是葉螨,它們已經(jīng)對96種化學農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性。擬除蟲菊酯類和線粒體抑制劑類殺螨劑是兩類重要的化學殺螨劑,因此研究害螨對擬除蟲菊酯類和線粒體抑制劑類殺螨劑的抗藥性機制對于兩類殺螨劑的長效使用以及害螨抗藥性綜合治理具有重要意義。本論文以朱砂葉螨為研究對象,全面研究了羧酸酯酶基因?qū)浊杈挣タ剐院投》タ剐孕纬傻淖饔?鑒定出了抗藥性相關(guān)的關(guān)鍵酯酶基因,并運用RNAi技術(shù)和蛋白表達技術(shù)明確了相關(guān)酯酶基因的功能,主要研究結(jié)果如下:1.生物測定和增效劑實驗室內(nèi)生物測定和增效劑實驗結(jié)果表明:甲氰菊酯抗性品系(FeR)的抗性倍數(shù)為118倍,丁氟螨酯抗性品系(CyR)的抗性倍數(shù)為34倍。酯酶抑制劑DEF(脫葉磷,S,S,S-tributyl phosphorotrithioate)顯著降低了FeR品系的抗性倍數(shù),卻明顯提高了CyR品系的抗性倍數(shù),表明酯酶均參與了朱砂葉螨對甲氰菊酯和丁氟螨酯抗藥性的形成,但扮演角色不同。2.酯酶粗酶活性檢測離體酯酶活性檢測結(jié)果表明:與SS品系相比,FeR品系和CyR品系體內(nèi)酯酶活性均顯著提高,進一步表明酯酶參與了朱砂葉螨抗藥性的形成。3.酯酶基因表達量檢測酯酶基因表達模式聚類分析結(jié)果顯示:FeR抗性品系中存在四條過量表達且積極響應(yīng)甲氰菊酯脅迫的酯酶基因(TcCCE06、TcCCE13、TcCCE15、TcCCE18),它們被視為參與朱砂葉螨甲氰菊酯抗性形成的關(guān)鍵酯酶基因。CyR品系中存在三條差異表達、能夠響應(yīng)丁氟螨酯脅迫的酯酶基因(TcCCE04、TcCCE12和TcCCE23);與FeR品系不同的是,上調(diào)酯酶基因(TcCCE04)受到丁氟螨酯脅迫后進一步上調(diào)而下調(diào)酯酶基因(TcCCE12和TcCCE23)在丁氟螨酯的脅迫下進一步下調(diào),暗示出酯酶基因通過上調(diào)和下調(diào)的協(xié)同作用,促進朱砂葉螨丁氟螨酯抗藥性的形成。4.RNAi驗證關(guān)鍵酯酶基因體內(nèi)功能RNAi干擾結(jié)果表明:甲氰菊酯抗性相關(guān)酯酶基因被沉默后(SS品系的沉默效率55-73%,FeR品系的沉默效率50-69%),SS品系體內(nèi)酯酶活性降低了0.34-0.44倍,FeR品系體內(nèi)酯酶活性降低了0.25-0.3倍;FeR品系對甲氰菊酯的抗性倍數(shù)也明顯下降,其中,TcCCE06基因?qū)eR抗性倍數(shù)的影響最大(由118.5倍降至106.3倍),被選為后續(xù)功能研究的代表基因;丁氟螨酯抗性相關(guān)酯酶基因同樣被有效沉默(SS品系的沉默效率64-80%,CyR品系的沉默效率55-64%),但沉默TcCCE04基因未顯著改變朱砂葉螨對丁氟螨酯的敏感性,表明此基因與丁氟螨酯抗性形成關(guān)系不大;沉默TcCCE12和TcCCE23基因后,CyR品系對丁氟螨酯的抗性倍數(shù)從18.96倍降低至1.14倍和1.14倍,表明這2條下調(diào)酯酶基因可能對丁氟螨酯抗藥性的形成具有重要作用。5.蛋白表達驗證關(guān)鍵酯酶基因體外功能蛋白表達結(jié)果表明:甲氰菊酯抗性相關(guān)酯酶基因TcCCE06和丁氟螨酯抗性相關(guān)酯酶基因TcCCE12成功表達出活性蛋白,它們對酯酶特異底物1-NA(1-萘酚乙酯,273.5μM)的活性分別為22.6 nM/min/mg和128 nM/min/mg。甲氰菊酯能夠競爭性抑制重組蛋白TcCCE06酯酶的活性,其IC_(50)為146.8μM;丁氟螨酯能夠競爭性抑制TcCCE12酯酶的活性,其IC_(50)為97.9μM。此外,重組蛋白TcCCE06酯酶能夠在3h內(nèi)代謝41.79%的甲氰菊酯;重組蛋白TcCCE12酯酶能夠在3h內(nèi)代謝36.9%的丁氟螨酯,并伴有水解產(chǎn)物含量升高的結(jié)果。6.可變剪接可能是改變基因表達量的一種途徑本研究首次發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶基因存在可變剪接現(xiàn)象。TcCCE23基因具有三個外顯子和兩個內(nèi)含子,其可變剪接發(fā)生于第一外顯子末端,可變剪接序列具有GT-AG特征,長度為18bp,屬于常見的5’可變剪接類型。此基因的兩條變體(V1和V2)存在于朱砂葉螨SS,CyR和FeR品系中,不同品系基因變體序列無差異,但是它們的表達量卻存在顯著差異:FeR品系體內(nèi)TcCCE23-V2的含量(93%)顯著高于SS品系(71%)和CyR品系(73%),暗示出TcCCE23-V2含量的提高可能與甲氰菊酯抗藥性形成有關(guān)。RNAi基因功能驗證結(jié)果也證實了TcCCE23-V2表達量變化可影響朱砂葉螨對甲氰菊酯的敏感性。除增加基因拷貝數(shù)和提高轉(zhuǎn)錄效率外,酯酶還可以通過可變剪接提高特異基因變體表達量參與抗藥性的形成。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S433
【圖文】：

人類目前沒有(也不可能有)萬靈的害蟲防治策略。害蟲具有適應(yīng)各類人工防治方法的能力，無論是生物防治，化學防治，基因工程防治還是 RNAi 防治，其對人工防治策略產(chǎn)生抗性是一種自然的結(jié)果[44]。同樣，沒有哪種農(nóng)藥會永久有效，生物(不僅局限于害蟲)抗藥性是基因多樣性的一種表現(xiàn)形式，所以害蟲抗藥性無法根除且一直會是化學防治的重大挑戰(zhàn)，因此持續(xù)關(guān)注和深入研究害蟲害螨抗藥性機制顯得尤為重要。1.3 害蟲/螨抗藥性機制1.3.1 靶標抗性靶標抗性是指害蟲基因序列改變導致靶標部位對藥劑敏感性降低而引起的抗藥性。害蟲一旦獲得靶標突變，便會永久對一(多)種藥劑甚至一(多)類藥劑產(chǎn)生抗藥性，且此抗性不能被農(nóng)藥增效劑抑制，被認為是危害最嚴重的一種抗藥性機制[45]。目前大部分殺蟲殺螨劑的作用靶標已經(jīng)被鑒定出來，如擬除蟲菊酯類、DDT 和三氯殺螨醇的作用靶標是電壓門控離子通道(para)[45-47]；有機氯類和苯吡唑類藥劑的作用靶標是 GABA 門控離子通道(Rdl)[48, 49]；有機磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的作用靶標是乙酰膽堿酯酶(ace)[50, 51]等�，F(xiàn)有殺蟲殺螨劑的作用形式主要包括 4 種類型：干擾神經(jīng)傳遞，抑制線粒體電子傳遞鏈，控制生長發(fā)育和擾亂腸道功能[37]。有些農(nóng)藥的作用靶標在螨和昆蟲中的相同，也有些作用靶標具有種屬特異性，這些特異性靶標位點為開發(fā)選擇性殺蟲殺螨劑提供了理論依據(jù)。

抗農(nóng)藥原藥數(shù)量的排名op resistant arthropods, based on the number of unique actien documented and the number of cases presented.倍體)[68]。筆者注意到部分文獻里的螨生活史的示意育階段，而實際上雄螨的前一個階段是第一若螨，而生活史示意圖做了修正(圖 3)。葉螨這種獨特的生殖方，因為雄性個體可以在種群中迅速傳播顯性基因，導致基因組也為抗性遺傳和機理研究提供了很大的便利[12想模型。

第一章 文獻綜述背景和意義 (Tetranychus cinnabarinus) 屬 于 蛛 形 綱 (Arachnida), 蜱 螨葉螨總科(Tetranychoidae)，葉螨科(Tetranychidae),是一種重要螨的防治多依賴于化學殺螨劑，但由于其世代周期短，繁殖藥性問題比其他農(nóng)業(yè)害蟲(螨)更為突出[136, 137]。筆者所外種群已經(jīng)對甲氰菊酯產(chǎn)生了較高水平的抗藥性[138]。我們性品系存在 kdr 突變(F1538I)，可能是介導甲氰菊酯抗性形，三大解毒酶 P450s、GSTs 和 CCEs 也在朱砂葉螨甲氰菊酯抗

【參考文獻】

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1 吳孔明,劉孝純,秦夏卿,婁國強;朱砂葉螨抗藥性研究[J];華北農(nóng)學報;1990年02期

本文編號：2802900