【摘要】：化學(xué)防治一直是保護(hù)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)免遭有害生物侵襲的主要方法,而有害生物抗藥性也給化學(xué)防治帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)。目前,世界上抗藥性問(wèn)題最突出的有害生物是葉螨,它們已經(jīng)對(duì)96種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性。擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)和線粒體抑制劑類(lèi)殺螨劑是兩類(lèi)重要的化學(xué)殺螨劑,因此研究害螨對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)和線粒體抑制劑類(lèi)殺螨劑的抗藥性機(jī)制對(duì)于兩類(lèi)殺螨劑的長(zhǎng)效使用以及害螨抗藥性綜合治理具有重要意義。本論文以朱砂葉螨為研究對(duì)象,全面研究了羧酸酯酶基因?qū)浊杈挣タ剐院投》タ剐孕纬傻淖饔?鑒定出了抗藥性相關(guān)的關(guān)鍵酯酶基因,并運(yùn)用RNAi技術(shù)和蛋白表達(dá)技術(shù)明確了相關(guān)酯酶基因的功能,主要研究結(jié)果如下:1.生物測(cè)定和增效劑實(shí)驗(yàn)室內(nèi)生物測(cè)定和增效劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:甲氰菊酯抗性品系(FeR)的抗性倍數(shù)為118倍,丁氟螨酯抗性品系(CyR)的抗性倍數(shù)為34倍。酯酶抑制劑DEF(脫葉磷,S,S,S-tributyl phosphorotrithioate)顯著降低了FeR品系的抗性倍數(shù),卻明顯提高了CyR品系的抗性倍數(shù),表明酯酶均參與了朱砂葉螨對(duì)甲氰菊酯和丁氟螨酯抗藥性的形成,但扮演角色不同。2.酯酶粗酶活性檢測(cè)離體酯酶活性檢測(cè)結(jié)果表明:與SS品系相比,FeR品系和CyR品系體內(nèi)酯酶活性均顯著提高,進(jìn)一步表明酯酶參與了朱砂葉螨抗藥性的形成。3.酯酶基因表達(dá)量檢測(cè)酯酶基因表達(dá)模式聚類(lèi)分析結(jié)果顯示:FeR抗性品系中存在四條過(guò)量表達(dá)且積極響應(yīng)甲氰菊酯脅迫的酯酶基因(TcCCE06、TcCCE13、TcCCE15、TcCCE18),它們被視為參與朱砂葉螨甲氰菊酯抗性形成的關(guān)鍵酯酶基因。CyR品系中存在三條差異表達(dá)、能夠響應(yīng)丁氟螨酯脅迫的酯酶基因(TcCCE04、TcCCE12和TcCCE23);與FeR品系不同的是,上調(diào)酯酶基因(TcCCE04)受到丁氟螨酯脅迫后進(jìn)一步上調(diào)而下調(diào)酯酶基因(TcCCE12和TcCCE23)在丁氟螨酯的脅迫下進(jìn)一步下調(diào),暗示出酯酶基因通過(guò)上調(diào)和下調(diào)的協(xié)同作用,促進(jìn)朱砂葉螨丁氟螨酯抗藥性的形成。4.RNAi驗(yàn)證關(guān)鍵酯酶基因體內(nèi)功能RNAi干擾結(jié)果表明:甲氰菊酯抗性相關(guān)酯酶基因被沉默后(SS品系的沉默效率55-73%,FeR品系的沉默效率50-69%),SS品系體內(nèi)酯酶活性降低了0.34-0.44倍,FeR品系體內(nèi)酯酶活性降低了0.25-0.3倍;FeR品系對(duì)甲氰菊酯的抗性倍數(shù)也明顯下降,其中,TcCCE06基因?qū)eR抗性倍數(shù)的影響最大(由118.5倍降至106.3倍),被選為后續(xù)功能研究的代表基因;丁氟螨酯抗性相關(guān)酯酶基因同樣被有效沉默(SS品系的沉默效率64-80%,CyR品系的沉默效率55-64%),但沉默TcCCE04基因未顯著改變朱砂葉螨對(duì)丁氟螨酯的敏感性,表明此基因與丁氟螨酯抗性形成關(guān)系不大;沉默TcCCE12和TcCCE23基因后,CyR品系對(duì)丁氟螨酯的抗性倍數(shù)從18.96倍降低至1.14倍和1.14倍,表明這2條下調(diào)酯酶基因可能對(duì)丁氟螨酯抗藥性的形成具有重要作用。5.蛋白表達(dá)驗(yàn)證關(guān)鍵酯酶基因體外功能蛋白表達(dá)結(jié)果表明:甲氰菊酯抗性相關(guān)酯酶基因TcCCE06和丁氟螨酯抗性相關(guān)酯酶基因TcCCE12成功表達(dá)出活性蛋白,它們對(duì)酯酶特異底物1-NA(1-萘酚乙酯,273.5μM)的活性分別為22.6 nM/min/mg和128 nM/min/mg。甲氰菊酯能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制重組蛋白TcCCE06酯酶的活性,其IC_(50)為146.8μM;丁氟螨酯能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制TcCCE12酯酶的活性,其IC_(50)為97.9μM。此外,重組蛋白TcCCE06酯酶能夠在3h內(nèi)代謝41.79%的甲氰菊酯;重組蛋白TcCCE12酯酶能夠在3h內(nèi)代謝36.9%的丁氟螨酯,并伴有水解產(chǎn)物含量升高的結(jié)果。6.可變剪接可能是改變基因表達(dá)量的一種途徑本研究首次發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶基因存在可變剪接現(xiàn)象。TcCCE23基因具有三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子,其可變剪接發(fā)生于第一外顯子末端,可變剪接序列具有GT-AG特征,長(zhǎng)度為18bp,屬于常見(jiàn)的5’可變剪接類(lèi)型。此基因的兩條變體(V1和V2)存在于朱砂葉螨SS,CyR和FeR品系中,不同品系基因變體序列無(wú)差異,但是它們的表達(dá)量卻存在顯著差異:FeR品系體內(nèi)TcCCE23-V2的含量(93%)顯著高于SS品系(71%)和CyR品系(73%),暗示出TcCCE23-V2含量的提高可能與甲氰菊酯抗藥性形成有關(guān)。RNAi基因功能驗(yàn)證結(jié)果也證實(shí)了TcCCE23-V2表達(dá)量變化可影響朱砂葉螨對(duì)甲氰菊酯的敏感性。除增加基因拷貝數(shù)和提高轉(zhuǎn)錄效率外,酯酶還可以通過(guò)可變剪接提高特異基因變體表達(dá)量參與抗藥性的形成。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S433
【圖文】：

人類(lèi)目前沒(méi)有(也不可能有)萬(wàn)靈的害蟲(chóng)防治策略。害蟲(chóng)具有適應(yīng)各類(lèi)人工防治方法的能力，無(wú)論是生物防治，化學(xué)防治，基因工程防治還是 RNAi 防治，其對(duì)人工防治策略產(chǎn)生抗性是一種自然的結(jié)果[44]。同樣，沒(méi)有哪種農(nóng)藥會(huì)永久有效，生物(不僅局限于害蟲(chóng))抗藥性是基因多樣性的一種表現(xiàn)形式，所以害蟲(chóng)抗藥性無(wú)法根除且一直會(huì)是化學(xué)防治的重大挑戰(zhàn)，因此持續(xù)關(guān)注和深入研究害蟲(chóng)害螨抗藥性機(jī)制顯得尤為重要。1.3 害蟲(chóng)/螨抗藥性機(jī)制1.3.1 靶標(biāo)抗性靶標(biāo)抗性是指害蟲(chóng)基因序列改變導(dǎo)致靶標(biāo)部位對(duì)藥劑敏感性降低而引起的抗藥性。害蟲(chóng)一旦獲得靶標(biāo)突變，便會(huì)永久對(duì)一(多)種藥劑甚至一(多)類(lèi)藥劑產(chǎn)生抗藥性，且此抗性不能被農(nóng)藥增效劑抑制，被認(rèn)為是危害最嚴(yán)重的一種抗藥性機(jī)制[45]。目前大部分殺蟲(chóng)殺螨劑的作用靶標(biāo)已經(jīng)被鑒定出來(lái)，如擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)、DDT 和三氯殺螨醇的作用靶標(biāo)是電壓門(mén)控離子通道(para)[45-47]；有機(jī)氯類(lèi)和苯吡唑類(lèi)藥劑的作用靶標(biāo)是 GABA 門(mén)控離子通道(Rdl)[48, 49]；有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的作用靶標(biāo)是乙酰膽堿酯酶(ace)[50, 51]等。現(xiàn)有殺蟲(chóng)殺螨劑的作用形式主要包括 4 種類(lèi)型：干擾神經(jīng)傳遞，抑制線粒體電子傳遞鏈，控制生長(zhǎng)發(fā)育和擾亂腸道功能[37]。有些農(nóng)藥的作用靶標(biāo)在螨和昆蟲(chóng)中的相同，也有些作用靶標(biāo)具有種屬特異性，這些特異性靶標(biāo)位點(diǎn)為開(kāi)發(fā)選擇性殺蟲(chóng)殺螨劑提供了理論依據(jù)。

抗農(nóng)藥原藥數(shù)量的排名op resistant arthropods, based on the number of unique actien documented and the number of cases presented.倍體)[68]。筆者注意到部分文獻(xiàn)里的螨生活史的示意育階段，而實(shí)際上雄螨的前一個(gè)階段是第一若螨，而生活史示意圖做了修正(圖 3)。葉螨這種獨(dú)特的生殖方，因?yàn)樾坌詡€(gè)體可以在種群中迅速傳播顯性基因，導(dǎo)致基因組也為抗性遺傳和機(jī)理研究提供了很大的便利[12想模型。

第一章 文獻(xiàn)綜述背景和意義 (Tetranychus cinnabarinus) 屬 于 蛛 形 綱 (Arachnida), 蜱 螨葉螨總科(Tetranychoidae)，葉螨科(Tetranychidae),是一種重要螨的防治多依賴(lài)于化學(xué)殺螨劑，但由于其世代周期短，繁殖藥性問(wèn)題比其他農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)(螨)更為突出[136, 137]。筆者所外種群已經(jīng)對(duì)甲氰菊酯產(chǎn)生了較高水平的抗藥性[138]。我們性品系存在 kdr 突變(F1538I)，可能是介導(dǎo)甲氰菊酯抗性形，三大解毒酶 P450s、GSTs 和 CCEs 也在朱砂葉螨甲氰菊酯抗

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 吳孔明,劉孝純,秦夏卿,婁國(guó)強(qiáng);朱砂葉螨抗藥性研究[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);1990年02期

本文編號(hào)：2802900