【摘要】：枇杷(Eriobotrya japonica)是原產(chǎn)我國(guó)的亞熱帶水果,其采收季節(jié)適逢高溫,采后果實(shí)不耐貯藏物流,低溫冷鏈貯藏物流是延緩采后批杷果實(shí)劣變腐爛的主要手段。紅肉枇杷'洛陽(yáng)青'在低溫貯藏物流時(shí)易罹患生理病害而出現(xiàn)冷害木質(zhì)化等癥狀,導(dǎo)致果肉中的木質(zhì)素含量升高,影響果實(shí)商品品質(zhì)。本研究采用熱激(HT)和程序性降溫(LTC)等處理,以延緩0℃貯藏過(guò)程中的批杷果實(shí)木質(zhì)化進(jìn)程,結(jié)合生物信息學(xué)、基因定量、雙熒光素酶、酵母單雜交、凝膠遷移率分析(EMSA)、轉(zhuǎn)基因等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段,研究確定了響應(yīng)低溫冷害的NAC和MADS家族成員,及其參與枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果豐富了原有的木質(zhì)素生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。主要結(jié)果如下:1.通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,克隆得到了 6個(gè)NAC成員。基因定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EjNAC3、EjNAC4、EjNAC5C7的表達(dá)量在0℃貯藏過(guò)程中逐漸上升,與果實(shí)冷害木質(zhì)化進(jìn)程呈現(xiàn)良好的正相關(guān)關(guān)系,但只有EjNAC3和EjNAC4顯著受到HT以及LTC處理的抑制;而EjNAC6和EjNAC8的表達(dá)水平隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降,與木質(zhì)化過(guò)程呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系,且LTC處理在后期能夠有效維持EjNAC6的表達(dá)水平。此外,通過(guò)酵母單雜交文庫(kù)篩選,以EjMYB8啟動(dòng)子為靶向,篩選獲得1個(gè)MADS成員,對(duì)其在0℃以及LTC條件下的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),EjMDS1受到LTC處理的顯著誘導(dǎo),且在0℃C貯藏下與果實(shí)木質(zhì)化過(guò)程呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。這些結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)錄水平層面上,EjNAC3、EjNAC4和EjMADS1是參與批杷果實(shí)木質(zhì)化的重要候選轉(zhuǎn)錄因子。2.研究確定了EjNAC3可直接調(diào)控木質(zhì)素代謝途徑結(jié)構(gòu)基因EjCAD-like。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),EjNAC3蛋白顯著激活了EjCAD-like啟動(dòng)子(約6倍),但對(duì)于批杷中其他木質(zhì)素生物合成途徑的結(jié)構(gòu)基因效應(yīng)有限;EjNAC4則暫未找到調(diào)控靶標(biāo)。擬南芥的結(jié)構(gòu)基因中,AtCAD5啟動(dòng)子受到EjNAC3的激活效應(yīng)最高(約1.5倍)。對(duì)EjCAD-like啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)了多個(gè)NAC蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。EMSA結(jié)果表明,EjNAC3蛋白對(duì)-502 bp至-454 bp區(qū)域結(jié)合作用較強(qiáng),但對(duì)-142bp至-103 bp區(qū)域的結(jié)合強(qiáng)度較低。酵母單雜實(shí)驗(yàn)證明了在體內(nèi)同樣能夠?qū)崿F(xiàn)EjNAC3蛋白與EjCAD-like啟動(dòng)子的直接結(jié)合。上述結(jié)果表明EjNAC3通過(guò)直接作用結(jié)構(gòu)基因的方式參與木質(zhì)素生物合成調(diào)控,其機(jī)制有別于傳統(tǒng)的次生細(xì)胞壁相關(guān)NAC成員。3.研究發(fā)現(xiàn)了EjMADS1-EjMYB8可形成級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)錄效應(yīng),參與調(diào)控枇杷果實(shí)木質(zhì)化。利用酵母單雜篩庫(kù),發(fā)現(xiàn)EjMADS1蛋白可以結(jié)合參與木質(zhì)化調(diào)控的激活型轉(zhuǎn)錄因子EjMYB8的啟動(dòng)子。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明,EjMADS1蛋白可顯著抑制EjMYB8啟動(dòng)子活性,但對(duì)于其余參與枇杷冷害木質(zhì)化的MYB成員無(wú)顯著影響,結(jié)合其表達(dá)模式與序列結(jié)構(gòu)信息,推測(cè)EjMADS1是枇杷果實(shí)木質(zhì)化的抑制型轉(zhuǎn)錄因子,并且是首個(gè)參與木質(zhì)化調(diào)控的MIKC*亞家族成員。在本實(shí)驗(yàn)室前期主要關(guān)注木質(zhì)素合成結(jié)構(gòu)基因Ej4CL1的基礎(chǔ)上,本研究發(fā)現(xiàn)了 EjNAC3蛋白可直接結(jié)合并激活木質(zhì)素合成結(jié)構(gòu)基因EjCAD-like啟動(dòng)子,參與調(diào)控枇杷果實(shí)木質(zhì)化。研究結(jié)果豐富了果實(shí)木質(zhì)化過(guò)程可被轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶標(biāo)基因范疇;同時(shí),在前期轉(zhuǎn)錄調(diào)控/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體研究的基礎(chǔ)上,本研究明確了MIKC*亞家族成員EjMADS1可轉(zhuǎn)錄調(diào)控木質(zhì)化相關(guān)EjMYB8轉(zhuǎn)錄因子,在果實(shí)木質(zhì)化研究中引入了級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。研究結(jié)果進(jìn)一步完善了批杷果實(shí)采后木質(zhì)化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S667.3;S426
【圖文】：

素單體的生物合成途徑（Ｖａｎｈｏｌｍｅ等，２０１０）逡逑邋Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｏｆ邋ｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌｓ逡逑素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控逡逑式植物中，大量的研究報(bào)道了邋ＮＡＣ與ＭＹＢ家族成員介入了次生細(xì)質(zhì)素生物合成的調(diào)控，形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Ｋｕｂｏ等，２００５；邋Ｍｉｔｓｕｄ；邋Ｏｈａｓｈｉ－Ｉｔｏ邋等，２０１０；邋Ｙａｍａｇｕｃｈｉ邋等，２０１１；邋Ｚｈｏｎｇ邋等，２００８）。逡逑道發(fā)現(xiàn)ＮＡＣ在木質(zhì)素單體的聚合中發(fā)揮了作用。擬南芥ＳＡ？／邋（ＮＡＣ參與木質(zhì)素單體的生物合成，也能夠直接結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域元件（ＷＮＮＹＢＴＮＮＮＮＮＮＮＡＭＧＮＨＷ邋）來(lái)調(diào)控木質(zhì)素大分子的聚２逡逑

與果實(shí)木質(zhì)化進(jìn)程呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，表達(dá)量持續(xù)下降。ＬＴＣ處理能夠在一定逡逑程度上維持母Ｍ４Ｃ６的水平表達(dá)，并且在貯藏后期，這種差異逐漸放大，達(dá)到了逡逑顯著程度；ＬＴＣ并未對(duì)句Ａ６４ＣＳ在０°Ｃ低溫下的表達(dá)摸式產(chǎn)生明顯影響（圖２．２）。逡逑Ｆ邐Ｄ３５逡逑＇邋．ＥＪ１ＷＡＣ３邋ＬＳＤ邋0，＝９．９５邋ＥＪＮＡＣ４邋ＬＳＤ0（）＝６．０９邋．邋３？逡逑Ｉ邐Ｉ邋｜＂0逡逑－“ｌｂ逡逑＾邋ＥｊＮＡＣ５邐ＬＳＤ（１0５＝１．０８邋ＥｊＮＡＣ６邋ＬＳＤｕ（ｌ邋＝０．４５９邋；邋２．５逡逑ｉ逡逑＼４２邋ＥｊＩＷＡＣ７邋ＬＳＤ（0邋＝１．９７邋ＥｊＮＡＣＨ邋ＬＳＤ０（ｔ邋＝０．３８８邋．邋，．５逡逑Ｌ．邋ｉ邋Ｌ邋ｌｌｉｌ邋Ｉ邋ｊ邋ｈ：逡逑０１２３４邋５邋６７８邐０１２３４邋５邋６７８邐■逡逑Ｓｔｏｒａｇｅ邋ｔｉｍｅ邋（ｄ）逡逑圖２．２批杷ＮＡＣ家族成員在ＬＴＣ條件下的基因表達(dá)模式逡逑標(biāo)準(zhǔn)誤由３個(gè)生物學(xué)重復(fù)計(jì)算所得。ＬＳＤ代表最小顯著差異法（Ｐ＜０．０５）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．２邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ｏｆ邋ｌｏｑｕａｔ邋ＮＡＣ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｔｏ邋ｃｏｌｄ邋（０

２基于轉(zhuǎn)錄組的ＮＡＣ家族成員克隆與表達(dá)分析逡逑２．２．３邋ＮＡＣ基因在ＨＴ中的基因表達(dá)分析逡逑由圖２．３可見(jiàn)，與ＬＴＣ處理相似，經(jīng)ＨＴ處理的所有ＮＡＣ基因表達(dá)模式可逡逑大致分為兩類(lèi)，一類(lèi)是ＥｊＮＡＣ３、ＥｊＮＡＣ４、ＥＪＮＡＣ５與ＥｊＮＡＣ７，它們的表達(dá)量被逡逑ＨＴ處理抑制，但僅母ＭＣ？和五與對(duì)照存在顯著差異；五彡從４０５和逡逑受ＨＴ處理影響不大。分析具有顯著差異的兩個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)以母凡４Ｃ３的表達(dá)量逡逑變化幅度最大，在８ｄ時(shí)，表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的１３％左右；而在響應(yīng)時(shí)間方面，逡逑母的表達(dá)量在第１邋ｄ時(shí)就已明顯受到抑制。逡逑６０邐１３５逡逑５0邋ＥｊＮＡＣ３邋ＬＳＤ（）０＝９．８３邋ＥｊＮＡＣ４邋ＬＳＤ（）０邋＝６．６５邋．邋３0逡逑４０邋ＪＨ0°Ｃ邐N邐Ｔ邋Ｔ邋－２５逡逑：ｒ邋ｈｔ邐ＩＬ邐Ｕ邐丨丨逡逑＇0邋．邋Ｌ．邋Ｌ．邋Ｌ邋－ｔ－ｊ＞．邋ｉ．邋Ｉｉ．邋Ｉ邋0逡逑＾邋＾邋ＥｊＮＡＣＳ邋ＬＳＤ00－１．０４邋ＥｊＮＡＣ６邋ＬＳＤ（｜0邋＝０．２９９－邋２．０逡逑４邋？逡逑１邋：ｉｉｉ邋Ｖｉｌ．ｌ邋ｌｉｌｉ．ｌｉ．Ｍ．ｉ＂逡逑＼Ｖ－ＥｊＮＡＣ７邋ＬＳＤ00＝２．０７邋ＥｊＮＡＣ８邋ＬＳＤ邋｜（１邋＝０．４７９＇邋１５逡逑１２邐，Ｍ＊邐１

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本文編號(hào)：2801342