【摘要】：飛蝗(Locusta migratoria)是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)害蟲,強(qiáng)大生殖力是飛蝗暴發(fā)成災(zāi)的一個(gè)重要生物學(xué)因素。昆蟲卵成熟過程中需要儲(chǔ)存大量的卵黃蛋白,為之后的胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),因此卵黃發(fā)生(vitellogenesis)是昆蟲生殖發(fā)育過程的重要事件。在以飛蝗為代表的昆蟲中,卵黃原蛋白(Vitellogenin,Vg)在脂肪體中合成,由血淋巴運(yùn)輸?shù)铰殉?被發(fā)育中的卵母細(xì)胞吸收。卵母細(xì)胞被一層致密排列的卵泡細(xì)胞層包裹,Vg首先需要穿過卵泡細(xì)胞間的通道(patency)才能到達(dá)卵母細(xì)胞表面,進(jìn)而被卵母細(xì)胞通過內(nèi)吞機(jī)制吸收。根據(jù)已有的報(bào)道,保幼激素(juvenile hormone,JH)能夠調(diào)控胞間通道的開啟,但是由于缺乏胞間通道在體內(nèi)和體外動(dòng)態(tài)變化的觀察方法,限制了胞間通道調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展。此外,JH調(diào)控胞間通道開啟的關(guān)鍵信號(hào)因子也有待揭示。飛蝗的卵黃生成和胞間通道開啟主要由JH調(diào)控,而且其胞間通道開啟對(duì)JH的響應(yīng)較為敏感,因此,飛蝗是研究保幼激素調(diào)控卵泡細(xì)胞間通道分子機(jī)制的一個(gè)理想模型。本論文利用飛蝗的優(yōu)勢(shì)展開三個(gè)方面的研究:一是通過使用合適的染料和方法對(duì)卵泡細(xì)胞進(jìn)行染色,建立起一套快速且清晰的觀察胞間通道的方法,為胞間通道的深入研究奠定基礎(chǔ),并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察不同發(fā)育階段卵泡細(xì)胞間通道的形態(tài)變化;二是建立JH誘導(dǎo)胞間通道開啟的動(dòng)態(tài)觀察模型,為研究JH調(diào)控胞間通道的分子機(jī)制研究體外模式;三是利用RNAi對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor,GPCR)的部分家族基因進(jìn)行功能分析,篩選影響胞間通道開啟的關(guān)鍵因子,初步解析JH調(diào)控胞間通道開啟的膜信號(hào)通路。研究結(jié)果顯示,CellMask Orange Plasma membrane Stain能夠在活細(xì)胞狀態(tài)下對(duì)卵泡細(xì)胞膜染色,且細(xì)胞的輪廓清晰,胞間通道的形態(tài)能夠直觀且完整顯示。正常發(fā)育條件下對(duì)各階段的卵泡細(xì)胞觀察表明,卵黃發(fā)生前期,首個(gè)卵母細(xì)胞長(zhǎng)度不超過1.5 mm時(shí),胞間通道處于關(guān)閉狀態(tài)。進(jìn)入卵黃發(fā)生期,首個(gè)卵母細(xì)胞長(zhǎng)度在1.5-5.5mm之間時(shí),胞間通道逐漸擴(kuò)大。在卵黃發(fā)生末期,首卵長(zhǎng)度大于5.5mm時(shí),胞間通道打開到最大狀態(tài),并在長(zhǎng)度超過6mm后迅速關(guān)閉。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè),胞間通道從卵黃發(fā)生前期的關(guān)閉狀態(tài),進(jìn)入卵黃發(fā)生期打開并逐漸增大,到卵黃發(fā)生末期短時(shí)間內(nèi)迅速關(guān)閉。在整個(gè)卵黃發(fā)生期,胞間通道打開后不再關(guān)閉,直至卵母細(xì)胞發(fā)育成熟。為了建立JH誘導(dǎo)胞間通道形成的體外模型,我們基于以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和文獻(xiàn)報(bào)道,利用JH III及其類似物(methoprene,JHA)在體外對(duì)處于卵黃發(fā)生中期的卵泡細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),觀察胞間通道的變化。結(jié)果顯示,在10~(-8)M的JH或JHA誘導(dǎo)條件下,胞間通道在1小時(shí)內(nèi)明顯增大。體外模型的建立可以為深入研究JH調(diào)控胞間通道形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供良好的實(shí)驗(yàn)材料,有助于推動(dòng)JH膜信號(hào)傳遞的分子機(jī)制研究。前期研究結(jié)果表明,可能是介導(dǎo)JH信號(hào)并調(diào)控胞間通道開啟的重要因子。我們利用RNAi對(duì)12個(gè)GPCR基因進(jìn)行了干擾,觀察其在卵黃發(fā)生中的作用。結(jié)果表明,其中的5個(gè)基因,包括orphan receptor(OrR)、cardioacceleratory peptide receptor(CCAPR)、methuselah-like 2(Mthl2)、parathyroid hormone/parathyroid hormone-related peptide receptor(PTHR)和tyramine receptor 2(TyR2),顯著影響卵巢生長(zhǎng)和卵母細(xì)胞成熟。進(jìn)一步的Western blot檢測(cè)顯示,OrR和CCAPR干擾后,Vg在脂肪體和血淋巴中的含量增多而在卵巢中減少,表明卵巢生長(zhǎng)和卵母細(xì)胞成熟受到抑制是因?yàn)槁涯讣?xì)胞不能正常吸收Vg導(dǎo)致,這兩個(gè)基因是否參與胞間通道調(diào)控而影響Vg吸收有待于進(jìn)一步研究。Mthl2、PTHR和TyR2干擾后,Vg在脂肪體中沒有變化,而在血淋巴和卵巢中減少;結(jié)果說明,Mthl2、PTHR和TyR2干擾后,卵巢生長(zhǎng)和卵母細(xì)胞成熟受到抑制是由Vg不能正常分泌到血淋巴中引起的。綜合上述結(jié)果,我們摸索了一套觀察胞間通道動(dòng)態(tài)變化的染色方法,建立了JH誘導(dǎo)胞間通道的體外模型。另外,我們篩選了兩個(gè)GPCR基因即OrR和CCAPR作為調(diào)控胞間通道開閉的候選基因。研究結(jié)果將為闡明JH調(diào)控卵泡細(xì)胞間通道的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)和參考。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S433.2
【圖文】：

圖 3-1 用不同的染色方式觀察到的胞間通道的形態(tài)Alexa Flour 488 Phalloidin 和 Hoeschst 33342（Sigma-Aldrich）染料對(duì)卵泡細(xì)胞色，觀察胞間通道形態(tài)；藍(lán)色部分顯示為細(xì)胞核，綠色部分顯示為細(xì)胞骨架。gglutinin, Alexa Flour 594 染料對(duì)卵泡細(xì)胞的細(xì)胞膜上多糖染色，觀察胞間通為細(xì)胞骨架。（C）CellMaskTMOrange Plasma membrane Stain 染料對(duì)卵泡細(xì)胞染色，觀察在活細(xì)胞狀態(tài)下胞間通道的形態(tài)；橘黃色部分顯示為細(xì)胞骨架Figure 3-1 Patency observed with different staining patterns激素類似物體外誘導(dǎo)胞間通道打開育狀態(tài)下胞間通道的形態(tài)不同發(fā)育階段胞間通道形態(tài)，我們收集正常發(fā)育各階段卵小管進(jìn)行數(shù)觀察。

圖 3-2 不同發(fā)育階段的胞間通道形態(tài)生前期，不同首卵長(zhǎng)度時(shí)卵小管的表型以及胞間通道的形態(tài)。（B）卵黃發(fā)生期小管的表型以及胞間通道的形態(tài)。（C）卵黃發(fā)生后期，不同首卵長(zhǎng)度時(shí)卵小以及胞間通道的形態(tài)Figure 3-2 Patency of the different development stages激素類似物劑量依賴性誘導(dǎo)胞間通道打開上研究，飛蝗卵巢在不同發(fā)育階段相對(duì)應(yīng)的胞間通道形態(tài)也不一樣。對(duì)胞間通道的影響，用 JH 類似物在體外對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察胞

e Insect Medium）中 37 oC 孵育 1 小時(shí)，將孵育后卵小管分別浸潤(rùn)、10-8M 和 10-9M JHA 的細(xì)胞培養(yǎng)基中，誘導(dǎo) 1 小時(shí)，并以未經(jīng) J對(duì)照。用 CellMaskTMOrange Plasma membrane Stain 染料對(duì)卵小管焦顯微鏡下觀察胞間通道。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng) JH 類似物誘導(dǎo)后胞間通道開，50 %不變結(jié)果。為提高誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性我們更換 Basal MedGlutamine 和 Schneider’s Drosophila Medium w/L-Glutamine (SDM)細(xì)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)結(jié)果仍不穩(wěn)定，后我們將 BME 和 SDM 培養(yǎng)基3 比例混合兩種后誘導(dǎo)胞間通道打開達(dá) 90 %以上。 對(duì)卵母細(xì)胞在 BME 和 SDM 混合培養(yǎng)基（2 : 3）中誘導(dǎo)后，如圖 M 和 10-9M 濃度的 JH 類似物 JHA 誘導(dǎo)卵小管后，胞間通道相較的，而用濃度為 10-6M 和 10-7M 的 JHA 誘導(dǎo)的胞間通道是沒有變 和 10-9M JH 類似物能夠誘導(dǎo)胞間通道打開，尤其 10-8M 的濃度誘

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本文編號(hào)：2783751