【摘要】：本研究以芳氧苯氧丙酸類除草劑禾草靈為底物,從長期受禾草靈污染區(qū),分離篩選了兩株功能菌。并對其生長特性及代謝途徑進行研究,推測了一條禾草靈礦化途徑,以期能為由此農(nóng)藥產(chǎn)生的環(huán)境污染治理及抗禾草靈轉(zhuǎn)基因作物的研究提供理論依據(jù)和微生物資源基礎(chǔ)。通過富集本研究篩選并純化了兩株禾草靈降解菌,命名為JT-3和JT-9。本文從培養(yǎng)特征及16S rRNA序列的同源性兩方面,鑒定JT-3菌為紅球菌屬(Rhodococcus),JT-9菌為短波單胞菌屬(Brevundimonas)。并分別從生長溫度、酸堿度、對NaCl的耐受度、最佳碳源四個方面對JT-3和JT-9進行了生長特性的研究。通過試驗得知,兩株禾草靈降解菌的最適生長溫度為30℃;最適生長pH值在7.0左右;低濃度的NaCl有利于他們的生長,高濃度會抑制生長;最佳碳源為葡萄糖,其后依次為果糖、乳糖、乙醇、淀粉。用HPLC和LC-ITMS對禾草靈的反應混合物進行檢測,發(fā)現(xiàn)3種代謝產(chǎn)物,并分別被鑒定為禾草靈酸(DC)、2,4-二氯苯酚(DCP)和2-(4-羥基苯氧基)丙酸(HPP)。隨后通過試驗確定兩株菌的關(guān)系為協(xié)同代謝。本文進一步以DCP為底物,研究了菌株JT-3代謝DCP的途徑。根據(jù)GC-MS的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)新的產(chǎn)物4-氯苯酚(4-CP)和4-氯鄰苯二酚(4-CC)并推測了禾草靈礦化途徑。對JT-3降解菌進行全基因組測序,根據(jù)測序所得的基因組序列草圖和注釋,發(fā)現(xiàn)可能參與反應的關(guān)鍵酶基因,并且通過RT-qPCR試驗檢測加入底物DCM或者DCP時,基因dcmA、dcmB1B2、dcmC、dcmD和dcmE的轉(zhuǎn)錄水平。試驗結(jié)果為基因dcmA、dcmB1B2、dcmC、dcmD和dcmE的轉(zhuǎn)錄水平都分別增加了345、271、57、49和82倍。說明這些基因的確參與了禾草靈的代謝。繼而構(gòu)建帶有組氨酸標簽的原核表達載體,轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)后,用IPTG誘導表達。本文采用高壓破碎的方式破碎細胞獲得粗酶液,用Ni-NTA-Sefinose Colum對目標蛋白進行純化,通過聚丙烯凝膠電泳對純酶液進行分析。電泳結(jié)果與根據(jù)酶基因序列計算得到的結(jié)果一致。購買部分代謝產(chǎn)物,驗證這些酶的確參與了DCP代謝反應,分別對DcmA、DcmB1B2、DcmC進行了降解驗證。另外,由于部分代謝產(chǎn)物沒通過商業(yè)途徑購買到,所以未能進行驗證。但是根據(jù)相關(guān)文獻的描述及對DcmC、DcmD和DcmE的同源性分析,進一步完整了禾草靈代謝途徑。
【學位授予單位】：淮北師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：X592;X172
【圖文】：

酸類[12,15]（Aryloxyphenoxypropionate,APP）除草圖 1-2 芳氧苯氧丙酸酯類除草劑結(jié)構(gòu)模式Fig. 1-2 Structural model of AOPP herbicides

禾草靈除草劑結(jié)構(gòu)模式

第一章 緒論氯苯氧基苯乙醚；（4）-（2,4）二氯苯氧基苯酚；（5）二氯苯酚；（6）苯酚。Figure 1-3 Possible pathway of the microbial degradation of diclofop-methyl .(1) diclofop-methyl(methyl-2-[4-(2,4-dichlorophenoxy)phenoxy] propanoate); (2) acid metabolite, diclofop acid; (3)4-(2,4-dichlorophenoxy)phenetole; (4) 4-(2,4-dichlorophenoxy)phenol; (5)2,4-dichlorophenol;(6) phenol.

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4 蔡喜運;金美青;葉t

本文編號：2782141