【摘要】：生防真菌在綠色防控的大背景下具有廣闊的應(yīng)用前景,發(fā)現(xiàn)一種有效的生防菌對(duì)于農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)都有重要意義。粉棒束孢作為一種蟲生真菌,其具有進(jìn)一步開發(fā)為生防菌劑的潛力。與此同時(shí),作為冬蟲夏草的定殖真菌,粉棒束孢的生物活性也越來越多地被研究和揭示,粉棒束孢菌絲體也具有規(guī)�；a(chǎn)藥物的潛力。這里所用菌株來自于青藏高原的冬蟲夏草菌的寄主昆蟲,明確菌絲體的生長(zhǎng)及其代謝與海拔高度的關(guān)系有重要意義,以期為進(jìn)一步開發(fā)利用粉棒束孢提供理論依據(jù)。通過對(duì)粉棒束孢的主要生物學(xué)特性及其菌絲體生產(chǎn)過程中響應(yīng)海拔高度變化的組學(xué)特征的研究,獲得的主要結(jié)果如下:1.用粉棒束孢接種草原害蟲貢嘎勾蝠蛾和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的6種害蟲,結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用浸泡法接種,粉棒束孢對(duì)貢嘎勾蝠蛾的感染率極高,證明了貢嘎勾蝠蛾是粉棒束孢的適宜寄主。而采用飼喂法接種,粉棒束孢對(duì)蝗蟲致死作用不明顯。采用浸泡法接種后不吸干水分的方式接種蚜蟲、小菜蛾、甜菜夜蛾、棉鈴蟲和大蠟螟,結(jié)果都有不同程度的致死作用;相反,如果采用吸干水分的方式接種,則都無致死效果。2.通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)的方法篩選出適合粉棒束孢菌絲體液體發(fā)酵的營養(yǎng)因素和培養(yǎng)條件,包括葡萄糖,牛肉膏,鐵元素,鎂元素和7:1的碳氮比,以及應(yīng)在裝有50 mL培養(yǎng)基的250-mL三角瓶中接入10%的菌種,在20℃,12h光照/12h黑暗,120rpm條件下培養(yǎng)。在此基礎(chǔ)上,采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)一步比較海拔高度對(duì)發(fā)酵菌絲體的代謝組影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),基于代謝組可以顯著區(qū)分430 m和2365 m海拔高度的發(fā)酵菌絲體。相對(duì)于高海拔,低海拔培養(yǎng)的菌絲體有417個(gè)代謝物質(zhì)顯著下調(diào),另有631個(gè)代謝物質(zhì)顯著上調(diào)。代謝物質(zhì)的顯著變化進(jìn)一步表明,海拔高度是真菌藥物質(zhì)量安全的重要影響因素之一。海拔高度調(diào)控物質(zhì)表達(dá)的特性也為促進(jìn)代謝物質(zhì)的生產(chǎn)提供了一種新篩選方法。上述結(jié)果為進(jìn)一步使用發(fā)酵罐規(guī)�；a(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的粉棒束孢菌絲體提供了理論基礎(chǔ)。3.在430 m和2365 m海拔高度的發(fā)酵結(jié)果表明,粉棒束孢在不同海拔高度的菌絲產(chǎn)量無顯著性差異。而轉(zhuǎn)錄組信息分析和q-PCR驗(yàn)證結(jié)果都表明,高海拔菌絲體呼吸過程中與氧受體相關(guān)的基因,如COX5A,QCR8,UQCRFS1,NDUFV1,NDUFA 和NDUFS7的表達(dá)都升高。由此推斷,粉棒束孢為適應(yīng)高海拔由有氧呼吸變?yōu)閰捬鹾粑?會(huì)直接導(dǎo)致其自身多消耗一部分能量用于厭氧呼吸過程中呼吸基質(zhì)的識(shí)別與傳遞;與此同時(shí),與氧受體相關(guān)的基因表達(dá)顯著升高,由此增產(chǎn)的能量可以滿足菌絲體厭氧呼吸而增加的能量需求,從而保持呼吸系統(tǒng)的功能穩(wěn)定,最終保證菌絲產(chǎn)量不變。這可能是粉棒束孢適應(yīng)海拔變化的轉(zhuǎn)錄機(jī)制。4.由于菌絲體的代謝受海拔高度顯著的調(diào)控,為發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的調(diào)控基因,對(duì)在430 m和2365 m海拔高度液體培養(yǎng)的菌絲體進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析,富集到與6個(gè)表達(dá)差異顯著物質(zhì)對(duì)應(yīng)的代謝通路,并在通路中篩選出具有顯著差異表達(dá)的基因,建立起代謝物質(zhì)與基因之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。這一結(jié)果為進(jìn)一步揭示基因功能,從而有針對(duì)性地構(gòu)建特殊活性物質(zhì)的表達(dá)載體提供了前期基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S476.12
【圖文】：

２．１實(shí)驗(yàn)材料逡逑２．１．１感病材料及供試寄主幼蟲逡逑在四川康定冬蟲夏草培殖基地生產(chǎn)過程中采集患病的貢嘎勾蝠蛾幼蟲（如圖２－１Ａ）和健康的逡逑不同齡期的貢嘎勾蝠蛾幼蟲。貢嘎勾蝠蛾幼蟲的生產(chǎn)方法與專利（尹定華等，２０１２）描述的方法逡逑相同。農(nóng)業(yè)害蟲種群有大蠟螺ｗｅ／／ｏ？ｅ／／ａ）、４牙蟲（卻Ａｉｓ邋ｇ７＿ｙｃｆ？ｅｓ）、幢蟲（Ｚｏｃｗｓｔｏｒ逡逑ｍｆｇｒａｔｏｎ＿ａ）、小菜蛾（Ｐ／ｗｔｅ〃ａ；＾／ｏｓｔｅ／／ａ）、棉鈴蟲（Ｚ／ｅ／ｚ＇ｃｏｖｅｒｐａａ７７？ｎ＇ｇｅｒａ）、菜青蟲（Ｐ／ｅ／ｉｙｒａｐａｅ）逡逑和甜菜夜蛾（如ｅ；ａ＾ｗａ）。除健康的大蠟娛種群購自天津惠裕德生物科技有限公司，概蟲、逡逑蝗蟲、小菜蛾、菜青蟲和甜菜夜蛾種群都由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治實(shí)驗(yàn)室提供。采用譚樹乾（２０１６）逡逑的飼養(yǎng)方法準(zhǔn)備供試蝗蟲，實(shí)驗(yàn)之前的所有蝗蟲都取食新鮮的室內(nèi)人工培育的幼嫩小麥麥苗；采逡逑用文獻(xiàn)報(bào)道（馮明光等，１９９６；單樂天和馮明光，２００６）的方法準(zhǔn)備待試蚜蟲，試蟲全部采用豆蚜逡逑的無翅成蚜，蟲齡控制在最后一次蛻皮后不超過２ｄ的齡期；采用文獻(xiàn)報(bào)道（劉樹峰等，２００７）的逡逑方法準(zhǔn)備甜菜夜蛾，選取健康且大小一致的３齡甜菜夜蛾幼蟲置于帶透氣孔的塑料培養(yǎng)皿中，以逡逑新鮮的人工配制飼料飼養(yǎng)２￣３ｄ后備用；采用文獻(xiàn)報(bào)道（刑靜等，２０１１）的方法準(zhǔn)備小菜蛾，選取逡逑健康且大小一致的３齡小菜蛾幼蟲置于塑料培養(yǎng)皿內(nèi)

大小為１．５？２．５邋ｎｍｘ邋１．３？３．０邋ｎｍ。分生孢子在產(chǎn)孢細(xì)胞頂端連接成鏈狀，長(zhǎng)者達(dá)１〗５隅。逡逑分生孢子鏈分散，直或彎曲，但絕不互相粘結(jié)成圓柱狀或球形頭狀物。分生孢子萌發(fā)時(shí)膨大成近逡逑球形，直徑約３．０邋 ，產(chǎn)生１？２根芽管（菌絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)見圖２－２Ａ，孢子見圖２－２Ｂ，萌發(fā)的分逡逑生孢子見圖２－２Ｃ）。完全符合《真菌手冊(cè)》關(guān)于粉棒束孢的特征，因此我們認(rèn)為所分離的病原菌逡逑為粉棒束孢。逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ逡逑：丨邋＝：＝：；＝；ｒ：；ｆ邋：：．逡逑圖２－２粉棒束孢的分生孢子。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｉｄｉａ邋ｏｆ邋Ｉｓａｒｉａ邋ｆａｒｉｎｏｓａ．逡逑Ａ：分生孢子梗（張德利等，２０１１）邋；邋Ｂ：分生孢子（張德利等，２０１１）邋；邋Ｃ：萌發(fā)的分生孢子。逡逑Ａ：邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅ；邋Ｂ：邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｉｄｉｕｍ．邋Ｃ：邋Ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ邋ｃｏｎｉｄｉａ．逡逑２．３．２分子鑒定逡逑表２－２邋ＩＴＳ１序列在ＮＣＢＩ網(wǎng)站上比對(duì)結(jié)果中位列前１０位的Ｚｓａｒ／ａ加菌株。逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｔｏｐ邋１０邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｂｌａｓｔ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ＩＴＳ１邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｔｒａｉｎ邋ａｎｄ邋ｔｈａｔ邋ｉｎ邋ＮＣＢＩ．逡逑Ｍａｘ邐Ｑｕｅｒｙ逡逑Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邐Ｔｏｔａｌ邋ｓｃｏｒｅ邐Ｅ邋ｖａｌｕｅ邐Ｉ邋ｄｅｎｔ

圖２－３基于ＴＵＢ基因，采用ＭＥＧＡ６．０軟件用ＵＰＧＭＡ構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｃｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ＩＴＳ邋ｇｅｎｅ邋ｂｙ邋ＵＰＧＭＡ邋ｏｆ邋ＭＥＧＡ邋６．０邋ｓｏｆｔｗａｒｅ逡逑在上述分子鑒定的基礎(chǔ)上，再綜合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，證明該病原菌為（粉棒束孢）。逡逑２１逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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