【摘要】：分生孢子是絲狀真菌普遍的繁殖方式,營(yíng)養(yǎng)脅迫誘導(dǎo)的產(chǎn)孢是真菌適應(yīng)環(huán)境的重要生存策略[1]。紫色紫孢菌(Purpureocillium lavendulum)是一類(lèi)重要的線蟲(chóng)生防真菌[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)該真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)菌落生長(zhǎng)受限并產(chǎn)生大量孢子,當(dāng)在PDA中添加真菌基本培養(yǎng)基(MM培養(yǎng)基)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后菌落增大。為了研究營(yíng)養(yǎng)脅迫如何通過(guò)表觀遺傳調(diào)控誘導(dǎo)真菌產(chǎn)孢,我們以P.lavendulum △ku80菌株為出發(fā)菌株,將紫色紫孢菌中的組蛋白H3上的第九位賴(lài)氨酸(H3K9)突變?yōu)楸彼?A),獲得P/H3K9A突變菌株。隨后將P/H3K9A突變菌株與△ku80菌株進(jìn)行表型分析,發(fā)現(xiàn)在PDA培養(yǎng)基上,P/H3K9A突變菌株菌落同樣增大,產(chǎn)孢量降低。推測(cè)紫色紫孢菌在PDA上受一定程度的營(yíng)養(yǎng)脅迫導(dǎo)致產(chǎn)孢且該過(guò)程依賴(lài)于表觀遺傳調(diào)控。為了驗(yàn)證這一推測(cè),本研究首先篩選PDA中缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并研究其代謝通路的功能。對(duì)P/H3K9進(jìn)行突變以模擬甲基化或乙�；刃揎�,比較其與△ku80菌株在不同培養(yǎng)基上的表型差異,同時(shí)對(duì)相應(yīng)組蛋白修飾酶進(jìn)行基因敲除,確定何種表觀遺傳修飾調(diào)控該產(chǎn)孢過(guò)程。利用轉(zhuǎn)錄組分析,獲得該調(diào)控通路的上下游基因。通過(guò)本項(xiàng)目的研究初步闡明營(yíng)養(yǎng)脅迫如何通過(guò)組蛋白H3K9的表觀遺傳調(diào)控誘導(dǎo)真菌產(chǎn)孢,為深入理解食線蟲(chóng)真菌生活史轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制及線蟲(chóng)的生物防治奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果:1.紫色紫孢菌組蛋白H3K9位點(diǎn)突變構(gòu)建氯嘧磺隆抗性基因(sur)敲入載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法,利用同源重組的原理將我們的篩選標(biāo)記(sur)敲入至紫色紫孢菌。成功獲得sur敲入菌株,結(jié)果顯示sur基因的表達(dá)并未對(duì)組蛋白H3,H4的表達(dá)量有影響。在此基礎(chǔ)上,我們將組蛋白H3的上游片段(含有組蛋白H3片段)與pEASY-Blunt Zero Cloning質(zhì)粒進(jìn)行連接,再以此連接載體為模板,對(duì)PlH3K9進(jìn)行不同形式的突變,獲得不同形式的的突變質(zhì)粒,近一步獲得PlH3K9A、PlH3K9R、PlH3K9L,PlH3K9Q四種突變菌株。2.構(gòu)建Pldim5敲除菌株構(gòu)建氯嘧磺隆抗性基因(sur)敲除載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法,利用同源重組的原理將Pldim5基因敲除,成功獲得APldim5菌株。3.PlH3K9突變菌株及相關(guān)酶基因敲除菌株的表型分析對(duì)PlH3K9A、PlH3K9R、PlH3K9L、PlH3K9Q 四種突變菌株,APldim5、APlgCn5菌株及Aku80菌株進(jìn)行表型分析。經(jīng)過(guò)觀察和統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)四種突變菌株與兩種敲除菌株和△ku80敲除菌株相比,突變菌株與敲除菌株在MM、PDA上生長(zhǎng)和產(chǎn)孢不同,而這種不同可以通過(guò)向PDA培養(yǎng)基中添加KN03、(NH4)2S04成分得到一定的改善。4.PlH3K9突變菌株及相關(guān)酶基因敲除菌株的轉(zhuǎn)綠組分析將不同突變菌株及敲除菌株與△ku80菌株在不同培養(yǎng)基上進(jìn)行接種培養(yǎng),收集不少于0.8 g的菌絲。將收集好的菌絲用液氮速凍,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。本論文的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn):真菌在營(yíng)養(yǎng)匱乏的環(huán)境中停止生長(zhǎng)并產(chǎn)孢是其重要的生存策略,從表觀遺傳調(diào)控的角度探討?zhàn)囸I誘導(dǎo)真菌生活史轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理并未見(jiàn)報(bào)道,本研究從組蛋白H3K9突變體出發(fā),通過(guò)篩選PDA中營(yíng)養(yǎng)脅迫的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),點(diǎn)突變模擬組蛋白修飾,轉(zhuǎn)錄組等方法試研究組蛋白H3K9介導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)孢的分子機(jī)制,為全面理解真菌適應(yīng)環(huán)境脅迫調(diào)控生活史轉(zhuǎn)變的生存策略奠定理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S476.1
【圖文】：

灰稱(chēng)翻抱

ＧＣＮ５是一個(gè)保守性較高的蛋白，在釀酒酵母中的同源蛋白為ＧＣＮ５，在構(gòu)逡逑巢曲霉中為ＧＣＮＥ，在黃曲霉中為ＧＣＮ５，都含有ＧＣＮ５相關(guān)的Ｎ－乙�；D(zhuǎn)移酶逡逑（ＧＮＡＴ）結(jié)構(gòu)域和Ｃ－末端溴結(jié)構(gòu)域如圖１－２所示，列出了不同物種中逡逑ＧＣＮ５的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。綜合以上，我們利用基因組數(shù)據(jù)，找到紫色紫孢菌中編碼逡逑ＧＣＮ５乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因并進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能上的研究。逡逑表１－１不同物種的Ｈ３Ｋ９甲基轉(zhuǎn)移酶逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１Ｈ３Ｋ９邋ｍｅｔｂｙｉｌｎｉｉｉｓｆｅｒａｓｅｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｐｅｃｉｅｓ逡逑引自邋Ｌａｃｈｎｅｒ

ＧＮＡＴ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｉ＝ｚ邋Ｂｒｏｍｏ邋ｄｏｍａｉｎ逡逑ｉ邋１邋ＰＣＡＦ，Ｎ－邋ｔｅｒｍｉｎａｌ逡逑圖１－２不同物種的ＧＣＮ５結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＧＣＮ５邋ｄｏｍａｉｎ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｐｅｃｉｅｓ逡逑引自邋Ｅｔｘｅｂｅｓｔｅ，邋Ｏ”邋ｅｔ邋ａｌ”邋２０１０逡逑６．本論文研究?jī)?nèi)容、方法和目的逡逑經(jīng)過(guò)我們的前期研[偡⑾鄭仙湘呔吧途暝冢校模僚嘌暇浜苠義閑”悴罅挎咦櫻諢九嘌ǎ停團(tuán)嘌郟擔(dān)保萆�，其菌落较ＰＤＡ中明辶x舷栽齟蟆４送�，查阅文献发夏[櫚鞍祝齲常耍刮壞愕謀砉垡糯奘尾斡胝婢納義銑び敕⒂虼吮韭畚囊允誠(chéng)叱嬲婢仙湘呔芯慷韻�，哉r捌諮芯康幕″義仙仙稈。校模寥狽Χ賈律ねＶ筒⒉叩撓煞鄭ü槐洌祝齲常耍�，琴Q(mào)義希校齲常耍剮奘蚊傅確椒ㄑ芯孔仙湘呔財(cái)扔盞疾叩謀砉垡糯骺鼗啤ｅ義希叮毖芯磕諶蒎義希保鄄歟校齲常耍梗鐐槐渚晟び氬咔榭�。将洲菌株中的｝x常耍雇槐湮義媳彼幔ǎ粒緯桑校齲常耍梗鐐槐渚輳俁員韌槐渚曖刖暝冢校模粒義希停團(tuán)嘌械納ず筒咔榭�。初步发现菌�

本文編號(hào)：2764529