【摘要】：桔小實蠅是世界上最重要的果蔬害蟲之一,卵產(chǎn)于果實內(nèi),孵化后的幼蟲在果實內(nèi)取食為害。桔小實蠅一生歷經(jīng)多次蛻皮和兩次變態(tài)發(fā)育(幼蟲到蛹和蛹到成蟲),這些進(jìn)程伴隨著一系列復(fù)雜的形態(tài)變化和生理生化反應(yīng),新表皮鞣化反應(yīng)是其中一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。桔小實蠅化蛹過程中新生成的白色柔軟蛹?xì)谳^短時間內(nèi)完成鞣化反應(yīng)(骨化和著色),以保護(hù)蟲體和快速適應(yīng)外界多變的生存環(huán)境。鑒定和挖掘害蟲特定發(fā)育階段的功能基因,對于研發(fā)環(huán)境友好型的生長調(diào)節(jié)劑有重要指導(dǎo)價值。本學(xué)位論文以桔小實蠅為研究對象,聚焦幼蟲變態(tài)發(fā)育過程的蛹?xì)坊磻?yīng),鑒定化蛹進(jìn)程中的關(guān)鍵通路基因,并深入分析重要基因的生理功能。主要研究結(jié)果如下:1桔小實蠅蛹?xì)坊P(guān)鍵通路基因的鑒定及其表達(dá)模式分析采用高通量測序技術(shù)對處于化蛹關(guān)鍵時間節(jié)點的桔小實蠅進(jìn)行表達(dá)譜測序,共獲得74.62 GB干凈數(shù)據(jù),各樣本與桔小實蠅基因組數(shù)據(jù)的匹配率為70.09%-74.44%,平均GC含量和Q30分別為41.54%和91.61%。進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到11,721條基因序列,其中11,301個基因能夠在桔小實蠅基因組中得到注釋,約占基因總數(shù)的83.76%,420個未能在基因組中得到注釋的基因可能為新基因。分析這些基因的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)有許多基因在化蛹過程中差異表達(dá),GO、COG和KEGG通路分析顯示氧化磷酸化通路、解毒代謝通路(P450)、保幼激素合成與代謝及信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)運(yùn)通路、蛻皮激素合成和信號通路、幾丁質(zhì)合成與代謝等通路均顯著富集,表明它們可能在化蛹過程中發(fā)揮重要功能。另外,與昆蟲表皮鞣化相關(guān)的酪氨酸代謝通路和表皮蛋白基因均在化蛹過程中變化顯著,暗示它們在桔小實蠅蛹?xì)坊磻?yīng)中具有重要作用�；诮坌嵪壔蚪M數(shù)據(jù)對酪氨酸代謝通路基因進(jìn)行注釋,共鑒定出24個關(guān)鍵基因�；谡n題組已有的桔小實蠅各發(fā)育階段(卵期、1齡幼蟲早期、1齡幼蟲晚期、2齡幼蟲早期、2齡幼蟲晚期、3齡幼蟲早期、幼蟲漫游期、幼蟲漫游晚期、白蛹期、6 h蛹?xì)ぁ?2 h蛹?xì)ぁ? d蛹、5 d蛹、蛹晚期和剛羽化成蟲)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析上述24個基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示酪氨酸羥化酶(BdTH)、多巴脫羧酶(BdDDC)、BdEbony、天冬氨酸脫羧酶(BdADC)、BdTan、BdMCO4、Bdyellow-c、Bdyellow-f和Bdyellow-f2基因均在蛹?xì)坊年P(guān)鍵時期高表達(dá),同時結(jié)合昆蟲體壁醌鞣化理論成功推導(dǎo)出桔小實蠅蛹?xì)坊磻?yīng)的通路圖:BdTH酶催化酪氨酸形成多巴(Dopa),大部分Dopa被BdDDC酶催化生成多巴胺(Dopamine);一部分Dopamine被BdMCO4、Yellow、Yellow-e和Yellow-h酶催化形成多巴胺色素(深棕色或者黑色),還有一部分Dopamine在BdEbony、BdADC和BdTan酶的相互配合催化下生成NBAD;接著被BdMCO4酶催化生成NBAD-醌,同時與表皮蛋白相互交聯(lián)形成鞣化蛋白進(jìn)而完成蛹?xì)す腔?而蛹?xì)ぶ磻?yīng)由NBAD-pigment(黃色或者紅棕色)和Dopamine色素共同完成。進(jìn)一步分析顯示,桔小實蠅蛹?xì)ず统上x體壁的鞣化反應(yīng)通路存在差異,羽化過程中的鞣化反應(yīng)主要依靠NADA-醌來完成。2桔小實蠅酪氨酸羥化酶基因在蛹?xì)坊^程中的功能研究以桔小實蠅蛹?xì)坊磻?yīng)通路關(guān)鍵的BdTH酶基因(蛹?xì)坊返钠鹗挤磻?yīng)酶和限速酶)為研究對象,利用巢式PCR技術(shù)在桔小實蠅老熟幼蟲表皮組織中克隆獲得BdTH的cDNA序列,完整開放閱讀框1737 bp,編碼578個氨基酸殘基,預(yù)測編碼蛋白的分子量65.3 kDa,理論等電點(pI)5.44。多重序列比對發(fā)現(xiàn),BdTH在N-末端不存在信號肽,但是擁有保守的酸性區(qū)域(PI=3.78)、絲氨酸位點(ser32)和C末端。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,BdTH序列與實蠅類昆蟲TH親緣關(guān)系較近,同時雙翅目昆蟲TH蛋白單獨聚為一支。采用定量qPCR和半定量RT-PCR技術(shù)分析BdTH的時空表達(dá)模式,結(jié)果顯示BdTH在老熟幼蟲表皮(EP)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)組織中高表達(dá),且在幼蟲向蛹期轉(zhuǎn)變過程中表達(dá)量顯著升高,暗示BdTH在蛹?xì)坊?骨化和著色)反應(yīng)中具有重要功能。對桔小實蠅5日齡幼蟲注射dsBdTH后,BdTH的mRNA表達(dá)量減少50-60%,試蟲羽化率下降到63%(對照組為94%)。相應(yīng)地對幼蟲注射或飼喂不同濃度的TH酶抑制劑(3-IT)后,試蟲羽化率隨著抑制劑濃度增加而顯著降低。飼喂高濃度TH抑制劑3-IT(10 mg/g)后,桔小實蠅幼蟲都能順利化蛹,但蛹?xì)ゎ伾儨\(著色不完全),且蛹?xì)と彳?骨化不完全),蛹重顯著降低。掃描電鏡結(jié)果顯示,抑制劑處理后的蛹?xì)け砻娉尸F(xiàn)異常表型,清晰的橫紋消失。而且飼喂抑制劑導(dǎo)致試蟲體內(nèi)多巴胺含量顯著降低,下游基因BdDDC和BdEbony表達(dá)量顯著上調(diào),表明蛹?xì)坊反嬖诜答仚C(jī)制。上述結(jié)果證明BdTH對于桔小實蠅蛹?xì)坊磻?yīng)至關(guān)重要,伴隨BdTH基因表達(dá)量下調(diào)和酶活被抑制,造成多巴胺合成路徑受阻,進(jìn)而對蛹?xì)坊磻?yīng)造成影響。此外,飼喂抑制劑3-IT導(dǎo)致老熟幼蟲體內(nèi)黑色素產(chǎn)生量顯著減少,4個抗菌肽基因(Bddefensin,Bdattacin,Bdcecropin-A和Bdcecropin-B)的表達(dá)量顯著下降,且對大腸桿菌的抵抗能力顯著降低。以上結(jié)果說明BdTH不僅參與桔小實蠅蛹?xì)さ镊坊磻?yīng),還參與幼蟲化蛹過程中的免疫反應(yīng)。3桔小實蠅多巴脫羧酶基因在蛹?xì)坊^程中的功能研究采用巢式PCR技術(shù),在桔小實蠅老熟幼蟲表皮中克隆獲得BdDDC的cDNA序列,完整開放閱讀框1428 bp,編碼475個氨基酸殘基,預(yù)測蛋白的分子量和理論等電點(pI)分別為53.3 kDa和6.29。多重序列比對顯示桔小實蠅DDC氨基酸序列分別與黑腹果蠅(82.53%)、家蠶(72%)和赤擬谷盜(74.53%)有較高的相似性。BdDDC序列在N-端含有糖基化位點、吡哆醛-5-磷酸結(jié)合位點和一段富含甘氨酸區(qū)域。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析結(jié)果顯示雙翅目昆蟲DDC蛋白單獨聚為一支。采用qPCR和半定量RT-PCR技術(shù)對BdDDC基因的時空表達(dá)模式進(jìn)行分析,結(jié)果顯示BdDDC主要在老熟幼蟲表皮和中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá),且該基因的表達(dá)量在桔小實蠅蛹?xì)坊?蛹?xì)ぶ妥冇?的關(guān)鍵時期顯著升高。進(jìn)一步從蛋白水平檢測不同發(fā)育階段BdDDC酶的活性變化,結(jié)果與BdDDC基因的表達(dá)模式一致,據(jù)此推測BdDDC在桔小實蠅化蛹及蛹?xì)坊磻?yīng)中具有重要功能。使用多巴脫羧酶抑制劑(L-α-M-D)飼喂桔小實蠅5日齡幼蟲,結(jié)果顯示高濃度抑制劑(20 mg/g)處理導(dǎo)致試蟲BdDDC酶活性顯著下降,參與表皮著色的4個關(guān)鍵基因(BdMCO4、Bdyellow-c、Bdyellow-f和Bdyellow-f2)的表達(dá)量均有一定程度的升高,試蟲體內(nèi)多巴胺含量顯著降低,化蛹時間推遲,出現(xiàn)大量黑化蛹,蛹重和羽化率顯著降低。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,飼喂高濃度BdDDC抑制劑(20 mg/g)導(dǎo)致試蟲蛹?xì)け砻鏅M紋消失,且呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài);冷凍切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛹?xì)ず穸蕊@著降低。上述結(jié)果證實BdDDC酶基因?qū)τ诮坌嵪売細(xì)坊磻?yīng)至關(guān)重要。4桔小實蠅CPs基因鑒定及CPAP3家族基因在蛹?xì)ば纬蛇^程中的功能研究4.1桔小實蠅CPs基因全基因組鑒定及其表達(dá)模式分析基于桔小實蠅基因組(NCBI Assembly:ASM78921v2),通過同源序列比對共鑒定出164個CPs基因,分屬于9個家族,包括:97個CPR、25個Tweedle、10個CPAP1、8個CPAP3、9個CPLCA、4個CPLCG、5個CPLCP、1個CPCFC和5個CPF家族基因。序列分析發(fā)現(xiàn),桔小實蠅各個表皮蛋白家族基因均有其特定的保守序列。CPR家族包含RR基序;Tweedle蛋白擁有4個保守氨基酸區(qū)域,區(qū)域I包含1個KX_2Y/F基序,區(qū)域II有1個KX_(4-5)FIKAP序列,區(qū)域III包含1個TX_2YVL基序,區(qū)域IV則包含KPEVYXFV/IKY序列;CPAP1和CPAP3蛋白分別有1個和3個幾丁質(zhì)結(jié)合域(ChtBD2);CPLCA蛋白包含保守的retinin結(jié)構(gòu)域;CPLCG蛋白序列包含35個氨基酸保守基序,且在這35個序列第9-20位上存在1個標(biāo)簽基序G-X_2-H-X-A-P-X_2-G-H;CPLCP家族蛋白序列中擁有高密度脯氨酸PV和PY重復(fù)序列;CPF家族擁有44個氨基酸殘基保守序列;CPCFC蛋白序列包含3個重復(fù)的16個氨基酸保守區(qū)域,且每個拷貝均以C-X_5-C基序結(jié)尾。選取黑腹果蠅(模式昆蟲)、地中海實蠅(與桔小實蠅親緣關(guān)系較近)以及鱗翅目、膜翅目和鞘翅目昆蟲的CPs進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果得出雙翅目昆蟲所特有的CPs基因簇和表皮發(fā)展模式;一些CPs基因在不同種類昆蟲間獨立進(jìn)化,另一些則主要基于特定保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)化。不同組織的表達(dá)模式分析顯示多數(shù)CPs基因在桔小實蠅外周表皮中有表達(dá);內(nèi)部器官如脂肪體、腸道、卵巢和精巢等組織中也檢測到相應(yīng)CPs基因的表達(dá),表明表皮蛋白家族基因功能的重要性和多樣性。桔小實蠅CPAP3家族基因序列不僅在昆蟲間非常保守,而且相較于其它CPs基因,其幾乎所有家族成員均在老熟幼蟲(化蛹前期)表皮中顯著高表達(dá),暗示它們可能參與桔小實蠅蛹?xì)さ男纬蛇^程。4.2桔小實蠅CPAP3家族基因在蛹?xì)ば纬蛇^程中的功能研究桔小實蠅CPAP3家族蛋白擁有3個保守幾丁質(zhì)結(jié)合域,暗示擁有潛在幾丁質(zhì)結(jié)合能力。選取CPAP3-D2和E蛋白,通過原核表達(dá)技術(shù)獲得重組蛋白,將純化獲得的蛋白與幾丁質(zhì)樹脂進(jìn)行孵育,二者與幾丁質(zhì)的結(jié)合效率分別為66.72%和52.78%,高于對照牛血清蛋白(18.06%)。CPAP3家族基因的時空表達(dá)模式顯示,CPAP3-A1、B、E和E2基因不僅在桔小實蠅老熟幼蟲表皮組織中高表達(dá),而且它們的表達(dá)量均在幼蟲化蛹關(guān)鍵時期顯著上調(diào);保幼激素類似物處理試蟲導(dǎo)致4個基因的表達(dá)量被顯著抑制,而蛻皮激素20E處理后這4個基因的表達(dá)均被顯著誘導(dǎo)。以上結(jié)果說明CPAP3家族基因可能在小實蠅化蛹過程中發(fā)揮作用。使用RNA干擾技術(shù),對桔小實蠅5日齡幼蟲分別注射CPAP3-A,B,E and E2基因的dsRNA,沉默效率在35%-60%之間,結(jié)果導(dǎo)致幼蟲發(fā)育顯著延遲,化蛹時間顯著延長。特別是RNA干擾降低BdCPAP-E基因的表達(dá)量后,造成40%的幼蟲死亡(軀體變得僵硬和緊繃,缺乏應(yīng)有的松弛性)。CPAP3-D2在卵期的表達(dá)量顯著高于其它任何一個發(fā)育階段,免疫組化分析結(jié)果顯示CPAP3-D2是桔小實蠅卵殼重要的結(jié)構(gòu)蛋白。定量結(jié)果顯示CPAP3-D2基因表達(dá)水平在桔小實蠅卵巢發(fā)育成熟過程中顯著升高,RNA干擾沉默該基因?qū)е侣殉舶l(fā)育和卵巢管形成受到顯著抑制。上述結(jié)果明確了桔小實蠅表皮蛋白家族基因不僅參與蛹?xì)ば纬?而且對于昆蟲的生殖發(fā)育亦至關(guān)重要。綜上所述,本學(xué)位論文聚焦桔小實蠅幼蟲化蛹這一關(guān)鍵時期,在完成該發(fā)育階段表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建,推導(dǎo)出蛹?xì)坊磻?yīng)通路圖的基礎(chǔ)上,分別靶向蛹?xì)坊返年P(guān)鍵基因BdTH、BdDDC和CPAP3,并進(jìn)行深入的功能探究,挖掘它們在桔小實蠅蛹?xì)坊磻?yīng)中的重要功能。研究結(jié)果不僅加深了對桔小實蠅鞣化反應(yīng)的認(rèn)識,同時篩選出的一些關(guān)鍵功能基因有可能成為害蟲防治新的作用靶點。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S433
【圖文】：

西南大學(xué)博士學(xué)位論文表在節(jié)間區(qū)域被深度折疊，導(dǎo)致蟲體軸向體長縮短；（4）在肌肉收縮的同于角質(zhì)層本身縱向收縮（longitudinal contraction）以及隨之而來體液壓力的增使蟲體表面逐漸變平，在這些過程的最后，角質(zhì)層變得穩(wěn)定；（5）幾乎在白殼形成的同時，鞣化反應(yīng)隨之在角質(zhì)層發(fā)生，從而形成昆蟲堅硬的蛹?xì)ぁＲ虼死ハx蛹?xì)ば纬蛇^程來看，不僅蟲體形態(tài)發(fā)生了顯著變化，在表皮內(nèi)部也發(fā)生烈的生理生化反應(yīng)（圖 1.1）。

圖 1.2 昆蟲體壁表皮結(jié)構(gòu)[11]Figure 1.2 Schematic diagram of the ultrastructure of insect cuticle昆蟲體壁表皮由上表皮（Epicuticle）和原表皮層（Procuticle）組成。根微結(jié)構(gòu)紋理，原表皮又可分為內(nèi)表皮（Endocuticle）和外表皮（Exocuticl昆蟲中，內(nèi)外表皮之間往往還會存在中表皮（Mesocuticle）層[12]。以赤Tribolium castaneum）成蟲體壁表皮為例（圖 1.2），其由里向外依次為（Epidermis cell）、內(nèi)表皮、中表皮、外表皮、上表皮和外殼層（Envelop部分都具有相應(yīng)的超微結(jié)構(gòu)特點和理化性質(zhì)，同時承擔(dān)著相應(yīng)的生理功皮細(xì)胞層是單一細(xì)胞層，細(xì)胞排列整齊，各個細(xì)胞間通過橋粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行聯(lián)要參與分泌、沉淀新表皮和吸收、溶離舊表皮[14, 15]。內(nèi)表皮是表皮層中層（10-20 μm），它是由皮細(xì)胞分泌所形成的最后一層表皮層，其主要成蛋白和幾丁質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體，同時內(nèi)表皮能使蟲體獲得特殊伸展和彎曲性也承擔(dān)著一定儲備營養(yǎng)成分的功能[16, 17]。內(nèi)表皮外面一層是外表皮（3-10過一系列鞣化反應(yīng)形成，顏色較深，是體壁表皮中最為堅硬的一層，當(dāng)時外表皮也將全部蛻去[18, 19]。昆蟲上表皮厚度 1-3 μm，不含幾丁質(zhì)，由

圖 1.3 昆蟲角質(zhì)層蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和兒茶酚交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)[11]Figure 1.3 Cross-linking network of cuticular proteins, chitin and catechols in insect cuticle昆蟲主要通過消化食物中的蛋白質(zhì)獲取酪氨酸（Tyrosine），而且由于該物在酚、氨基、羧基等重要官能團(tuán)，因此酪氨酸在昆蟲體內(nèi)發(fā)揮著多種多樣的功能。特別是酪氨酸作為雙酚化合物合成前體，其代謝通路在昆蟲表皮鞣化中具有重要功能[40]。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲鞣化通路始于酪氨酸，具體路徑如圖示[11, 31, 39]：首先，利用酪氨酸羥化酶（TH, Tyrosine hydroxylase）將酪氨酸羥后形成多巴（Dopa）；隨后，通過多巴脫羧酶（Dopa decarboxylase）將新合多巴脫去羧基生成昆蟲體內(nèi)重要生物胺—多巴胺（Dopamine）；另外通過多化酶（Multicopper oxidase gene）即漆酶（Laccase），將黑色素前體物質(zhì)多巴巴胺分別氧化成多巴醌（Dopa-quinone）和多巴胺醌（Dopamine-quinone），用 yellow 家族酶將這些醌類物質(zhì)轉(zhuǎn)換成二羥吲哚（Dihydroxyindole）和 5,6-二吲哚-2-羧酸（5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid），接著這兩種物質(zhì)則進(jìn)一氧化成黑色或者棕色物質(zhì)；對于昆蟲表皮骨化反應(yīng)，多巴胺被芳烷基胺 N-乙轉(zhuǎn)移酶（Arylalkylamine N-acetyltransferase, aaNAT）和 Ebony 酶催化分別生

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 梁欣;陳斌;喬梁;;昆蟲表皮蛋白基因研究進(jìn)展[J];昆蟲學(xué)報;2014年09期

2 張文慧;侯海霞;楊瓊;王淑會;毛旭連;劉永杰;;蟲酰肼對斜紋夜蛾幼蟲多巴脫羧酶基因表達(dá)的影響[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年08期

3 周樹堂;郭偉;宋佳晟;;昆蟲變態(tài)的激素與基因調(diào)控[J];生物學(xué)通報;2012年09期

4 韓宇;劉春;魏麗婉;任靜波;劉品彥;夏慶友;;家蠶酪氨酸羥化酶基因BmTh的表達(dá)及功能[J];昆蟲學(xué)報;2010年09期

5 孔令斌;林偉;李志紅;黃冠勝;梁憶冰;;氣候因子對橘小實蠅生長發(fā)育及地理分布的影響[J];昆蟲知識;2008年04期

6 張曉錄,張逢春,李堯華;酪氨酸羥化酶與帕金森病的關(guān)系研究[J];北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2005年03期

7 胡兆農(nóng),呂敏,姬志勤,祁志軍,吳文君;氮酮對兩種殺蟲劑毒力及昆蟲表皮蠟質(zhì)層影響的初步研究[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報;2004年02期

8 陳錫群,蔡定芳;酪氨酸羥化酶與帕金森病[J];國外醫(yī)學(xué).神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊;2001年01期

9 高明媛;昆蟲表皮中碳?xì)浠衔镌诶ハx分類中的應(yīng)用[J];昆蟲學(xué)報;2001年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 楊文佳;桔小實蠅幾丁質(zhì)和保幼激素合成與代謝中重要基因的研究[D];西南大學(xué);2014年

2 梁九波;家蠶表皮蛋白基因的表達(dá)譜分析及表皮蛋白BmorCPT1的功能研究[D];西南大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 宋巧娟;多巴脫羧酶（DDC）對擬黑多刺蟻生長發(fā)育的調(diào)控及其與蛻皮激素受體（EcR）和雌激素相關(guān)受體（ERR）關(guān)聯(lián)性研究[D];陜西師范大學(xué);2017年

2 曹治珊;棉鈴蟲漆酶Ⅱ基因的分子鑒定及功能分析[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 李黎;家蠶黑化免疫初探[D];西南大學(xué);2013年

4 余志濤;飛蝗漆酶基因mRNA表達(dá)及功能研究[D];山西大學(xué);2012年

5 桂江;家蠶酪氨酸羥化酶表達(dá)純化及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究[D];蘇州大學(xué);2012年

本文編號：2753605