發(fā)布時間：2020-06-29 06:57

【摘要】：蘋果輪紋病是世界上最嚴重的蘋果病害之一,它主要是由Botryosphaeria dothidea(B.dothidea)引起的。蘋果是我國的主要經(jīng)濟作物,在蘋果的生產(chǎn)過程中,蘋果輪紋病能夠造成蘋果果實產(chǎn)量和品質(zhì)的顯著下降,導致嚴重的經(jīng)濟損失。因此,研究蘋果對輪紋病的抗性機制對于提高蘋果果實的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義。前人研究表明,泛素化途徑在多種生物脅迫反應中發(fā)揮著關鍵作用。泛素化是由泛素激活酶E1,泛素結合酶E2和泛素連接酶E3通過一系列的酶促級聯(lián)反應完成的。其中,E3泛素連接酶決定了靶蛋白的特異性,從而促進了下游靶蛋白的泛素化。本研究中,我們報道了一個蘋果BTB-BACK結構域的E3泛素連接酶蛋白POZ/BTB CONTAINING-PROTEIN 1(MdPOB1),通過轉基因的方法研究了它在蘋果對病原菌B.dothidea的防御方面發(fā)揮的作用。并通過體內(nèi)和體外實驗研究了MdPOB1蛋白在蘋果輪紋病抗性機制中發(fā)揮作用的分子機理。主要研究工作和結果如下:1.MdPOB1抑制蘋果對B.dothidea的防御能力生物信息學分析顯示,MdPOB1(基因序列號:MD07G1143200)含有一個保守的BTB-BACK結構域,并且與AtPOB1具有較高的同源性。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化獲得了MdPOB1過量表達(MdPOB1-OVX)和抑制表達(MdPOB1-ANTI)的蘋果愈傷組織,并通過瞬時注射的方法獲得了過量表達(MdPOB1-IL60)和抑制表達(MdPOB1-TRV)的瞬時轉化蘋果果實。接種B.dothidea后發(fā)現(xiàn),過量表達的蘋果愈傷組織和蘋果果實均降低了對它的防御能力,而抑制表達的蘋果愈傷組織和蘋果果實均提高了對它的防御能力。說明MdPOB1能夠抑制蘋果對B.dothidea的防御能力。2.MdPOB1蛋白與MdPUB29蛋白互作并能夠將其泛素化降解為了探究MdPOB1抑制蘋果對B.dothidea防御能力的分子機制,首先利用酵母雙雜交的方法篩選到了一個蘋果U-box結構域的E3泛素連接酶MdPUB29與MdPOB1蛋白互作,并通過pull-down實驗和雙分子熒光互補實驗進一步驗證了MdPOB1蛋白與MdPUB29蛋白之間的互作。體外蛋白降解實驗以及體內(nèi)泛素化實驗表明MdPOB1蛋白能夠通過泛素/26S蛋白酶體途徑促進MdPUB29蛋白的降解。3.MdPUB29增強蘋果對B.dothidea的防御能力生物信息學分析顯示,MdPUB29(基因序列號:MD01G1010900)含有一個保守的U-box結構域,并且與AtPUB29親緣關系最近,同源性最高。亞細胞定位顯示MdPUB29定位于細胞核中。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化獲得了MdPUB29過量表達(MdPUB29-OVX)和抑制表達(MdPUB29-ANTI)的蘋果愈傷組織,以及異位表達MdPUB29的擬南芥植株。接種B.dothidea后發(fā)現(xiàn),過量表達的蘋果愈傷組織和轉基因擬南芥植株均提高了對B.dothidea的防御能力,而抑制表達的蘋果愈傷組織則降低了對B.dothidea的防御能力。說明MdPUB29能夠增強蘋果對B.dothidea的防御能力。4.MdPOB1以依賴于MdPUB29的方式抑制蘋果對B.dothidea的防御能力為了進一步研究MdPOB1抑制蘋果對B.dothidea防御能力的機制,通過瞬時注射的方法獲得了MdPOB1抑制表達(MdPOB1-TRV),MdPUB29抑制表達(MdPUB29-TRV)以及MdPOB1和MdPUB29共同抑制表達(MdPOB1-TRV+MdPUB29-TRV)的瞬時轉化蘋果果實。接種B.dothidea后發(fā)現(xiàn),單獨抑制MdPOB1表達的蘋果果實提高了對它的防御能力,而單獨抑制MdPUB29表達以及共同抑制MdPOB1和MdPUB29表達的蘋果果實均降低了對它的防御能力。說明MdPOB1以依賴于MdPUB29的方式抑制蘋果對B.dothidea的防御能力。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S432.44
【圖文】：

導底物特異性，在泛素化酶促級聯(lián)反應中具有至關重要的作用（BerndsenandWolberger,2014; Furniss et al., 2018）。泛素化降解蛋白質(zhì)需要通過泛素化蛋白酶體途徑來實現(xiàn)，蛋白酶體存在于細胞質(zhì)和細胞核，是一種由十到二十個亞基組成的蛋白復合物（金曉琴等,2014; 劉詩o鄣

本文編號：2733564