【摘要】：昆蟲病原真菌球孢白僵菌作為一種重要的生物防治菌劑,在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。然而,微生物菌劑的田間穩(wěn)定性和殺蟲速度仍然不能令人滿意,并且已成為影響真菌殺蟲劑應(yīng)用的重要因素。海藻糖不僅可以作為體內(nèi)重要的碳源,還在許多生物的環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用。海藻糖合成代謝通路中,第二步是由6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(Tpp)催化6-磷酸海藻糖合成海藻糖,球孢白僵菌的海藻糖合成代謝通路是調(diào)控真菌生長發(fā)育、抗逆和致病力的重要樞紐,但目前關(guān)于生防真菌中海藻糖代謝的生物學(xué)功能的研究報(bào)道有限,本文以6-磷酸海藻糖磷酸酯酶基因作為切入點(diǎn),利用同源重組的方法敲除BbTpp基因,通過Tpp基因的缺失對菌株的抗逆力和毒力產(chǎn)生的影響,解析其功能機(jī)制,為菌株改良提供了新的思路。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(一)首先通過對分生孢子的大小、產(chǎn)孢量和萌發(fā)率比較分析,在SDAY平板上培養(yǎng)期間,ΔBbTpp產(chǎn)孢困難,第7d的分生孢子產(chǎn)量比野生型菌株明顯下降98.1%;在萌發(fā)率的測定中,分生孢子GT_(50)在ΔBbTpp菌株中較野生型菌株延長6.5%;在菌落面積的實(shí)驗(yàn)中,ΔBbTpp菌落面積在14種CZP衍生的不同碳氮源培養(yǎng)基平板上的菌落面積縮小68~83%。通過流式細(xì)胞儀測定孢子大小實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),ΔBbTpp敲除菌株的的大小和復(fù)雜度較野生菌株上升11%和50%,表明BbTpp調(diào)節(jié)球孢白僵菌產(chǎn)孢量和孢子特性。(二)通過高效液相色譜法測定球孢白僵菌的胞內(nèi)海藻糖的含量,與野生菌株相比,ΔBbTpp的海藻糖含量顯著下降了96%,在敲除菌株中幾乎沒有海藻糖的生成,驗(yàn)證了Tpp參與海藻糖合成途徑,表明BbTpp是球孢白僵菌中海藻糖合成所必須的。BbTpp主要通過調(diào)節(jié)海藻糖合成途徑調(diào)控海藻糖的積累,從而影響球孢白僵菌分生孢子的抗逆和毒力。(三)然后,在化學(xué)脅迫的實(shí)驗(yàn)中,ΔBbTpp對不同化學(xué)脅迫的敏感性都高于野生菌株,ΔBbTpp敲除菌株對氧化劑H_2O_2和甲萘醌的EC_(50)分別較野生菌株下降了20%和27%;ΔBbTpp分生孢子對剛果紅的胞壁干擾脅迫抵抗力下降18%;在高溫脅迫和UV-B輻射實(shí)驗(yàn)中,ΔBbTpp分生孢子對紫外輻射脅迫的耐受力比野生菌株降低20%,對45°C高溫脅迫的半致死時間LT_(50)比野生型降低15%,ΔBbTpp敲除菌株在耐氧化、耐熱和耐紫外等外部逆境壓力方面都有所下降。(四)最后,在毒力生物測定中通過體壁感染,BbTpp的缺失導(dǎo)致LT_(50)從3.9d延長到8.3天;通過血腔注射,BbTpp的缺失引起致死50%大蠟螟幼蟲的LT_(50)從4.8 d延長到5.8 d,而該基因的異位回補(bǔ)則使得該缺陷得以恢復(fù)。ΔBbTpp敲除菌株的毒力顯著降低,說明BbTpp在較大程度上影響球孢白僵菌的生防潛能�？傊�,Tpp在維持海藻糖合成、分生孢子質(zhì)量、多重耐受性和毒力方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,這突出了它們對真菌對環(huán)境和宿主的適應(yīng)性的重要性。
【學(xué)位授予單位】：齊魯工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S476.12
【圖文】：

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本文編號：2728554