【摘要】：隨著我國(guó)城市園林綠化事業(yè)的大力發(fā)展,每年產(chǎn)生了大量的園林綠化廢棄物,如何將城市園林綠化廢棄物變廢為寶成為亟待解決的問題。以堆肥技術(shù)為代表的生物處理方法,可以實(shí)現(xiàn)園林綠化廢棄物資源化利用,但園林綠化廢棄物中木質(zhì)素和纖維素含量高,導(dǎo)致堆肥效率低。為了加快園林綠化廢棄物堆肥效率,擬從堆肥中篩選出高效的木質(zhì)素和纖維素降解菌,并通過誘變技術(shù)提高它們對(duì)木質(zhì)素和纖維素降解能力,并探討其基因功能、擴(kuò)繁工藝以及酶學(xué)特性。利用苯胺藍(lán)和羧甲基纖維素(CMC)-剛果紅培養(yǎng)基褪色圈法、實(shí)驗(yàn)室固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)、酶活力定量檢測(cè),共篩選到了3株相對(duì)優(yōu)勢(shì)的木質(zhì)素和纖維素降解菌:枯草芽孢桿菌(B.subtilis)BL03、曲霉菌屬(Aspergillus sp.)BL06、土芽孢桿菌屬(Geobacillus sp.)BL15,其中 B.subtilis BL03 產(chǎn) CMC 纖維素酶和漆酶,Aspergillus sp.BL06 產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶,Geobacillus sp.BL15產(chǎn)CMC纖維素酶。利用常壓室溫等離子(ARTP)對(duì)分離出的菌誘變并定向篩選,發(fā)現(xiàn)Aspergillus sp.BL06對(duì)ARTP誘變不敏感、致死率不明顯,而Geobacillus sp.BL15誘變后未篩選到有明顯突變的菌株,故暫停該兩株菌的誘變和篩選工作�？刂艬.subtilis BL03誘變條件,使其在致死率約95%進(jìn)行誘變�；诿笜�(biāo)儀,以對(duì)苯胺藍(lán)脫色率為指標(biāo),結(jié)合在CMC-剛果紅培養(yǎng)基褪色圈直徑,對(duì)B.subtilis BL03誘變后突變株進(jìn)行了初篩;再通過濾紙法觀察透明圈、測(cè)定酶活力等方法復(fù)篩,確定了 2株正向突變株,并觀察其基因穩(wěn)定性。最終確定1株突變株B.subtilis BLAR1,20代傳代培養(yǎng)后,CMC纖維素酶和漆酶活力分別為(U/mL):162.67、21.30,較B.subtilis BL03 分別提高 49.69%和 35.18%。將B.subtilis BLARl和BL03應(yīng)用到園林綠化廢棄物堆肥試驗(yàn),并以黃孢原毛平革菌(P.chrysosporium)和未接菌劑的空白處理作為對(duì)照,在堆肥開始(0d)和堆肥30 d兩次添加了堆肥菌劑。通過堆肥試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):①以CMC和苯胺藍(lán)為底物篩選得到B.subtilis BL03在園林綠化廢棄物堆肥中具有較好的木質(zhì)素和纖維素降解能力,60 d堆肥較不加菌劑的空白對(duì)照,顯著提高木質(zhì)素降解率6.25%、纖維素降解率46.92%;②經(jīng)ARTP誘變,獲得的突變株B.subtilis BLAR1較B.subtilis BL03顯著提高了纖維素降解能力10.5%,但木質(zhì)素降解能力沒有提高,與在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)狀態(tài)下酶活力提高的幅度有較大差距。利用Illumina Hiseq Xten,對(duì)B.subtilis BL03和BLAR1進(jìn)行了全基因組分析,觀察到該兩菌在GO功能基因庫(kù)方面的基因沒有明顯的區(qū)別。分析碳水化合物代謝相關(guān)的基因,發(fā)現(xiàn)B.subtilis BLAR1較BL03在碳水化合物酯酶基因方面增加了 1條CAZy基因數(shù)據(jù)庫(kù)中EC10家族基因,該基因與乙酰木聚糖酯酶、肉桂酰酯酶、阿魏酸酯酶、羧酸酯酶、S-甲酰谷胱甘肽水解酶等酶相關(guān),可能突變株酶活力增強(qiáng)與此有關(guān),有待進(jìn)—步驗(yàn)證和研究。為了便于菌劑產(chǎn)業(yè)化擴(kuò)繁,研究獲得了B.subtilis BLAR1工業(yè)級(jí)培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖9.0、甜菜糖蜜15.0、玉米漿干粉20.0、黃豆餅粉20.0;最適培養(yǎng)溫度為37℃、在恒溫振蕩器的培養(yǎng)最經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)速是200 rpm、最適初始生長(zhǎng)pH范圍是5.5-6.5,培養(yǎng)周期24h。將上述實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)繁參數(shù)與菌劑工廠的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)相結(jié)合,提出了菌劑生產(chǎn)工藝手冊(cè)——《堆肥菌劑B.subtilis BLAR1擴(kuò)繁工藝手冊(cè)》,詳見附錄A。B.subtilis BLAR1所產(chǎn)CMC纖維素酶和漆酶最大積累時(shí)間度分別為48 h和60 h;酶活力最適pH都是6.0-9.0;最適溫度是30-50℃,這些特性有利于該菌酶系在園林綠化廢棄物堆肥中發(fā)揮作用。在酶誘導(dǎo)劑試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)微晶纖維素和玉米芯對(duì)B.subtilis BLAR1產(chǎn)CMC纖維素酶有顯著的誘導(dǎo)作用,而玉米秸稈和麥麩沒有誘導(dǎo)作用;愈創(chuàng)木酚、香蘭素、DL-苯丙氨酸對(duì)B.subtilis BLAR1產(chǎn)漆酶沒有誘導(dǎo)效果。鑒于B.subtilis BLAR1最適生長(zhǎng)溫度在37℃,而所產(chǎn)CMC纖維素酶和漆酶活力最適溫度都是30-50℃,為了提高該菌在園林綠化廢棄物堆肥中使用效果,建議在環(huán)境達(dá)到30℃堆肥時(shí)使用,加入堆肥后菌劑中微生物會(huì)快速繁殖,高溫期結(jié)束后,溫度降到40℃附近再次添加菌劑,促進(jìn)堆體腐熟。
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S141.4
【圖文】：

林綠化廢棄物腐熟中木質(zhì)素和纖維素降解菌的篩選誘變及擴(kuò)繁緊密相連組成的多相固體（Ｃｈｕｎｄａｗａｔ，Ｂｅｃｋｈａｍ邋ｅｔ邋ａｌ．．邋２０１１）支撐，植物將是柔幵的原生質(zhì)堆（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，邋２００５）。這些材素、半纖維素，為了適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境、抵御病蟲害，這些物質(zhì)質(zhì)纖維素，他們以纖維素為骨架物質(zhì)，半纖維素覆蓋在纖隙由木質(zhì)素與半纖維素填充，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的疏水結(jié)構(gòu)狀態(tài)（。所以園林綠化廢棄物的木質(zhì)素和纖維素含量高、Ｃ／Ｎ比降解利用。逡逑

Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆｌｉｇｎｉｎ逡逑家對(duì)園林綠化廢棄物處理的指導(dǎo)政策簡(jiǎn)述逡逑棄物的處理方法有很多，我國(guó)傳統(tǒng)上采用焚燒或填埋的簡(jiǎn)便，但焚燒過程中會(huì)產(chǎn)生大量的煙氣，以及甲烷和二２０１４ａ），加之近年我國(guó)許多城市霧霾污染越來越嚴(yán)重，禁止（童紀(jì)新、王青青，２０１８；吳群紅、郝艷華，２０１８）。

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本文編號(hào)：2722196