【摘要】：禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病,是小麥生產(chǎn)上的重要病害,不僅導(dǎo)致小麥嚴(yán)重減產(chǎn),還產(chǎn)生影響食品安全的真菌毒素。生物防控小麥赤霉病,能減少化學(xué)殺菌劑的施用,被認(rèn)為是一種發(fā)展前景良好的防控途徑。解淀粉芽孢桿菌S76及其產(chǎn)生的脂肽,能高效抑制禾谷鐮刀菌,可開發(fā)成為控制小麥赤霉病的生物制劑。但是,芽孢桿菌及其脂肽與鐮刀菌和小麥互作的分子機(jī)理尚無系統(tǒng)研究。同時,在田間感染了赤霉病的小麥,在儲藏過程中麥粒的菌群及其毒素的變異規(guī)律如何,也不十分清楚。本研究利用分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、植物病理學(xué)的理論與技術(shù),研究了S76菌株、S76產(chǎn)生的脂肽伊枯草菌素(Iturin,Itu)和豐原素(Fengycin,Fen)與禾谷鐮刀菌和小麥的分子互作;利用宏基因組學(xué)、化學(xué)等技術(shù),研究了受赤霉菌侵染的小麥,在儲藏過程中菌群及其毒素的變異。主要結(jié)果如下:1.伊枯草菌素、豐原素和S76菌株與禾谷鐮刀菌的多個基因互作,這些基因參與鐮刀菌的不同代謝路徑。通過基因芯片表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),伊枯草菌素和豐原素及其產(chǎn)生菌對麥角固醇合成、細(xì)胞膜磷脂合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞壁合成、聚糖合成與分解、糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)錨定結(jié)構(gòu)合成與GPI錨定蛋白等基因的表達(dá)有顯著影響。進(jìn)一步敲除了鐮刀菌的這些基因,分析了基因缺失突變體對兩種脂肽的反應(yīng),結(jié)合化學(xué)分析、磷酸化免疫檢測,結(jié)果一致表明伊枯草菌素和豐原素在禾谷鐮刀菌中具有多個靶點(diǎn):包括膜脂、GPI錨定結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜錨定蛋白(Ankyrin,ANK)以及細(xì)胞內(nèi)蛋白。伊枯草菌素和豐原素通過控制鐮刀菌甘油高滲透壓調(diào)控(High-Osmolarity Glycerol,HOG)和細(xì)胞壁整合調(diào)控(Cell Wall Integrity,CWI)信號路徑參與形成囊泡結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步通過化學(xué)分析、磷酸化免疫檢測,結(jié)果表明伊枯草菌素和豐原素通過誘導(dǎo)HOG信號路徑調(diào)控滲透物質(zhì)甘油的合成,以提高細(xì)胞內(nèi)滲透壓,同時誘導(dǎo)CWI信號路徑調(diào)控幾丁質(zhì)的合成,降低細(xì)胞壁的保護(hù)作用,是其引起鐮刀菌產(chǎn)生囊泡結(jié)構(gòu)重要原因。2.伊枯草菌素和豐原素能誘導(dǎo)小麥的赤霉病抗性、促進(jìn)小麥生長、延緩小麥萌發(fā)以及抑制赤霉菌毒素合成的作用。RNAseq表達(dá)譜分析表明,伊枯草菌素和豐原素可激活小麥活性氧、超敏反應(yīng)、控制氣孔關(guān)閉、泛素化降解、水楊酸和乙烯等抗病基因以及激素合成調(diào)控基因表達(dá),促進(jìn)小麥胼胝體沉積和雙氧水積累,提高小麥的赤霉病抗性。通過分析赤霉菌在侵染小麥過程中毒素合成路徑基因表達(dá)及化學(xué)測定小麥籽粒的毒素含量結(jié)果表明,伊枯草菌素和豐原素能顯著抑制鐮刀菌毒素合成基因表達(dá),降低麥粒中的毒素含量。3.S76菌株誘導(dǎo)侵染小麥的禾谷鐮刀菌的水解酶類基因表達(dá)。RNAseq表達(dá)譜分析表明,S76菌株能誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌纖維素酶、半纖維素酶及糖苷酶等多糖水解酶基因表達(dá)。敲除禾谷鐮刀菌水解酶基因,對敲除突變子后培養(yǎng)基中碳源利用和致病力分析研究表明,禾谷鐮刀菌纖維素酶(Fg01596)和糖基水解酶(Fg06873)基因通過降解小麥細(xì)胞壁的纖維素為菌絲生長提供碳源,進(jìn)而增強(qiáng)禾谷鐮刀菌對小麥的致病能力。4.小麥儲藏不同時間(0、3、6、9和12個月)、不同位置(上層、中層和下層)的菌群類型和毒素含量變化很大。在儲藏開始(0月)時,真菌菌群中存在105個能被分類鑒定的物種(81個屬),其中4個的相對含量超過10%,包括鏈格孢(12%)、花狀絨黑粉類酵母(27%)、禾谷鐮刀菌(12%)和好干性酵母(12%);還有41個尚不能被分類鑒定的物種。在糧倉的上層中,真菌的多態(tài)性和鐮刀菌的相對豐度顯著低于中層和下層。在儲藏3個月后雪腐鐮刀烯醇(Nivalenol,NIV)和脫氧雪腐鐮刀烯醇(Deoxynivalenol,DON)毒素含量比0月時高13%-34%,儲藏6至12個月時,中層和下層麥粒毒素的含量比0月時高24%-57%。但黃曲霉菌和黃曲霉毒素在儲藏開始時及儲藏過程中的含量都很低。這些研究結(jié)果為揭示S76菌株控制禾谷鐮刀菌的分子機(jī)理、發(fā)展基于S76菌株的小麥赤霉病防控技術(shù)提供了信息和依據(jù),還為降低小麥儲藏過程中鐮刀菌毒素污染提供了信息和方法。
【圖文】：

圖 2-1 同源敲除策略圖EO：新霉素抗性基因；NEOpf 和 NEOpr：擴(kuò)增抗性標(biāo)記基因引物；upf 和 upr：擴(kuò)同源區(qū)引物，upr 與 NEO 抗性基因 5’端有 15 bp 的重疊區(qū)；dpf 和 dpr：擴(kuò)增下游同物，，dpf 與 NEO 抗性基因 3’端有 15 bp 的重疊區(qū)；ujdpf 和 ujdpr：上游同源區(qū)特異點(diǎn)鑒定引物；djdpf 和 djdpr：下游同源區(qū)特異插入位點(diǎn)鑒定引物。Fig. 2-1 The schema for homologous knockoutEO: Neomycin resistence gene; NEOpf and NEOpr: the primers of amplication neomsistence gene; upf and upr: the primers of amplication up stream homologus region, upr bp overlap region with neomycin resistence gene 5’; dpf and dpr: the primers of amplica stream homologus region, dpf have 15 bp overlap region with neomycin resistence gendpf and ujdpr: indentification primers of specific insert site on up stream homologus regdpf and djdpr: indentification primers of specific insert site on down stream homologus reg2.7.2.2 Cassette1）分生孢子制備

3.2ITS2 和 V3V4 區(qū)域 PCR 擴(kuò)增，利用真菌的通用引物 ITS3（5’-GAACGCAGC-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-NA 的 ITS2 區(qū)域，利用細(xì)菌通用引物 341F（5’-ACTCCTACGG-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）擴(kuò)增細(xì)區(qū)域。擴(kuò)增出的 ITS2 和 V3V4 擴(kuò)增子按照 Illumina 測序分析的ra DNA library Prep Kit（New England Biolabs, Inc., USA）建成文庫，文庫在華大基因公司（BGI, Wuhan, China）利用 PE250 平臺測序分析。華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆博士研究生學(xué)位論文
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.12;S476.1


本文編號：2703371