【摘要】：灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是典型的死體營養(yǎng)型植物病原真菌,寄主范圍極其廣泛,能夠侵染1400多種植物,其引起的灰霉病對全球范圍的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害,帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來,隨著全基因組序列的公開,灰葡萄孢菌致病的分子機(jī)理得到了廣泛研究,使得人們對灰葡萄孢菌與寄主互作過程的認(rèn)識(shí)不斷更新。盡管已鑒定出多個(gè)致病相關(guān)基因,但該菌的致病調(diào)控機(jī)制尚未被充分發(fā)掘。構(gòu)建突變體庫是挖掘新基因及進(jìn)行功能基因組學(xué)研究的有效途徑,本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系(ATMT),構(gòu)建了一個(gè)約含9000個(gè)轉(zhuǎn)化子的灰葡萄孢菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化子群體,采用番茄和草莓兩種不同的寄主葉片進(jìn)行致病性篩選,經(jīng)三輪復(fù)篩從中獲得400多個(gè)致病力喪失或下降的突變體。通過熱不對稱交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)進(jìn)行側(cè)翼序列的克隆及分析確定T-DNA的整合部位,從T-DNA標(biāo)記的基因中選取了三個(gè)候選基因進(jìn)行后續(xù)研究,并分別命名為BcNOP53、BcRAB-6A及BcSNF2。為研究候選基因的生物學(xué)功能及作用機(jī)理,我們對其進(jìn)行了定向敲除及遺傳互補(bǔ),通過檢測基因敲除突變體ΔBcnop53、ΔBcrab-6a及ΔBcsnf2的致病力,進(jìn)一步確認(rèn)了候選基因BcNOP53和BcSNF2與T-DNA插入突變體致病表型的相關(guān)性,并對其在調(diào)控病原物發(fā)育和致病過程中的生物學(xué)功能和機(jī)制展開了系統(tǒng)的研究。核糖體是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)生物合成的重要細(xì)胞器,然而目前對于核糖體如何調(diào)節(jié)微生物的致病過程知之甚少。本研究結(jié)果表明,BcNop53具有與酵母Nop53p類似的功能,是核糖體60S亞基成熟后期的作用因子,對病原菌的生長、致病發(fā)育及致病力至關(guān)重要。BcNop53定位于細(xì)胞核內(nèi),該蛋白在酵母突變體ΔScnop53中表達(dá)能夠完全恢復(fù)后者生長緩慢的缺陷;同樣,BcNOP53基因缺失導(dǎo)致灰葡萄孢菌生長速率減慢。研究還發(fā)現(xiàn),BcNOP53基因缺失導(dǎo)致灰葡萄孢菌致病力喪失且侵染結(jié)構(gòu)形成受阻與病原物中活性氧(ROS)產(chǎn)生減少有關(guān)。此外,BcNop53缺失降低了灰葡萄孢菌分生孢子產(chǎn)量及對逆境脅迫的適應(yīng),改變了分生孢子及菌核形態(tài),延緩分生孢子與菌核的萌發(fā),并降低了細(xì)胞壁降解酶的活性;然而,ΔBcnop53菌核數(shù)量顯著增加。將完整的BcNOP53基因?qū)毽cnop53能夠完全恢復(fù)上述表型缺陷。Snf2家族是一類依賴ATP的解旋酶類似(helicase-like)蛋白,能夠通過水解ATP獲得能量來改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu),從而改變組蛋白與DNA之間的接觸,以便完成DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組或修復(fù)等生物學(xué)過程。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),BcSnf2是該家族中的一員,其在病原真菌中的生物學(xué)功能尚未見報(bào)道,本研究發(fā)現(xiàn),BcSnf2在灰葡萄孢菌發(fā)育及致病過程中具有重要的作用,可調(diào)節(jié)某些特定基因的轉(zhuǎn)錄水平,推測Bc Snf2可能通過調(diào)控某些致病因子的轉(zhuǎn)錄水平參與灰葡萄孢菌的致病過程。BcSNF2基因缺失導(dǎo)致灰葡萄孢菌致病力顯著減弱,同時(shí)導(dǎo)致灰葡萄孢菌生長速率下降、產(chǎn)孢量降低、孢子萌發(fā)遲緩、菌落與菌核的形態(tài)發(fā)生改變。利用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)對ΔBcsnf2與野生型B05.10基因差異表達(dá)水平進(jìn)行了分析,在差異表達(dá)基因中,除與生長發(fā)育相關(guān)的基因外,還富集到一些參與致病過程的基因,其中包括已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的灰葡萄孢菌致病因子,我們將在后續(xù)的研究中對BcSnf2及Snf2家族其他成員調(diào)控灰葡萄孢菌自身發(fā)育及其與寄主互作過程的機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的分析。簡言之,本研究以灰葡萄孢菌為材料,構(gòu)建T-DNA插入突變體庫,從中鑒定出BcNOP53和BcSNF2兩個(gè)新穎的致病相關(guān)基因并對其進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)功能分析,闡釋了灰葡萄孢菌生長、致病發(fā)育和侵入寄主等有賴于BcNop53調(diào)控相關(guān)蛋白合成及內(nèi)源活性氧ROS產(chǎn)生的機(jī)制;同時(shí)解析了Snf2家族成員BcSnf2調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,影響病原菌生長發(fā)育及致病的生物學(xué)功能。本研究為核糖體發(fā)生及依賴ATP的染色質(zhì)重塑復(fù)合物介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控調(diào)節(jié)真菌致病過程的機(jī)制提供了新的見解,可能為解決真菌疾病開辟新的靶點(diǎn),為作物灰霉病綠色防控提供理論依據(jù)。
【圖文】：

灰葡萄孢菌的侵染循環(huán)(Amselemetal.,2011)

Fig.2.8 The feature map of the gene BC1G_02571 in Botrytis cinerea5）轉(zhuǎn)化子 M7280該轉(zhuǎn)化子致病力喪失，接種草莓及番茄葉片后，無可見病斑出現(xiàn)。TAIL-PCR 獲得 259 bp T-DNA 片段，T-DNA 插入基因 BC1G_08709 與BC1G_08710 之間，該插入位點(diǎn)距離 BC1G_08709 起始密碼子 90 bp，距離BC1G_08710 起始密碼子 201 bp （圖 2.9）。 BC1G_08709 基因由 1366 個(gè)核苷酸組成，包含 2 個(gè)外顯子（圖 2.10），，編碼 437 個(gè)氨基酸的未知蛋白，包含一個(gè) NOP53結(jié)構(gòu)域；灰葡萄孢菌基因組數(shù)據(jù)庫序列信息顯示，BC1G_08710 基因序列全長為888 bp, 包含 3 個(gè)外顯子，編碼 207 個(gè)氨基酸的假定 GTP-binding 蛋白，包含結(jié)構(gòu)域 Rab6 和 Ras，NCBI 最新數(shù)據(jù)顯示 BC1G_08710 基因序列全長為 564 bp（圖2.11），本研究中 BC1G_08710 基因序列參考灰葡萄孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中的序列信息。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S432.44

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張艷杰;沈鳳英;許換平;李亞寧;劉大群;;灰葡萄孢菌多樣性研究進(jìn)展[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2017年06期

2 白丁;優(yōu)質(zhì)葡葡酒的生產(chǎn)——世界釀酒新發(fā)明(之二)[J];食品機(jī)械(食品工藝與機(jī)械);1989年01期

3 李旭;張輝;胡吉林;肖圣雄;李愛桃;李霞;姚飛虹;劉學(xué);李強(qiáng)國;;嘧霉胺的標(biāo)準(zhǔn)生成焓及其抗灰葡萄孢菌作用[J];中國科學(xué):化學(xué);2010年09期

4 黃蓉;胡建坤;黃瑞榮;繆南生;馬輝剛;劉甫祥;;環(huán)境條件對灰葡萄孢菌菌核萌發(fā)的影響[J];植物病理學(xué)報(bào);年期

5 王春梅;張杰;陳浩;石志琦;范永堅(jiān);;天然化合物丁香酚對灰葡萄孢菌絲脂質(zhì)過氧化和膜損傷的影響[J];農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào);2009年01期

6 丁中,劉峰,慕立義;不同抗性型灰葡萄孢菌Botrytis cinerea對不同作用機(jī)制殺菌劑的敏感性研究[J];農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào);2001年04期

7 劉佳;張劍云;朱廷恒;汪琨;崔志峰;;灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)基因組中T-DNA整合模式分析[J];微生物學(xué)報(bào);2011年02期

8 林慧珍;茍萍;;灰葡萄孢菌的誘變及其致病性研究[J];新疆農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年05期

9 張?jiān)迫A;張立軍;邱德文;楊秀芬;曾洪梅;袁京京;;灰葡萄孢菌激活蛋白對番茄灰霉病的誘導(dǎo)抗性及防御相關(guān)酶活性的影響[J];河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年03期

10 哈斯格根;艾啟俊;魏月琴;吳振宇;張霞;;中草藥提取物對蔬菜兩種采后病原真菌的抑菌活性研究[J];北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);2009年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 關(guān)麗杰;楊迪;邵雙;李海燕;;灰葡萄孢菌拮抗放線菌的篩選[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2009年

2 吳明德;張蕾;李國慶;;灰葡萄孢菌菌株CanBc-1的致病力衰退及其與dsRNA的關(guān)系[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

3 吳明德;張蕾;李國慶;姜道宏;;灰葡萄孢菌致病力衰退相關(guān)病毒(BcDRV)及其DI RNA全長cDNA的克隆及序列分析[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2009年

4 高俊明;劉慧平;王建明;李新鳳;韓巨才;;灰葡萄孢菌nit突變體的誘導(dǎo)及其在營養(yǎng)體親和性測定中的應(yīng)用[A];中國植物病理學(xué)會(huì)第七屆代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2002年

5 徐艷芳;張佳星;李玲;王華弟;張傳清;;鐵皮石斛內(nèi)生真菌分離及對灰葡萄孢菌頡頏作用的篩選[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2017年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2017年

6 張蕾;李國慶;劉勇;;灰葡萄孢菌對不同殺菌劑的抗藥性研究[A];公共植保與綠色防控[C];2010年

7 畢朝位;仇劍波;周明國;陳長軍;王建新;;多菌靈對禾谷鐮孢菌分生孢子萌發(fā)和有絲分裂的影響[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2009年

8 余海忠;劉慧宏;雷思遠(yuǎn);肖作安;楊霄;;魚腥草石油醚超聲波法提取物抑菌作用研究[A];植物保護(hù)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)——中國植物保護(hù)學(xué)會(huì)2007年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2007年

9 陳淑寧;羅朝喜;袁會(huì)珠;;灰葡萄孢多重抗藥性菌株的適合度和競爭力[A];綠色生態(tài)可持續(xù)發(fā)展與植物保護(hù)——中國植物保護(hù)學(xué)會(huì)第十二次全國會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2017年

10 楊晨宇;張易;楊秀芬;;蛋白激發(fā)子BcGS1激活番茄免疫的功能及功能域鑒定[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2016年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2016年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 曹勝男;致病相關(guān)因子BcNop53和BcSnf2調(diào)控灰葡萄孢菌生長發(fā)育及致病性機(jī)理研究[D];吉林大學(xué);2018年

2 張?jiān)迫A;灰葡萄孢菌激活蛋白的純化、基因克隆與功能研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

3 張靜;湖北省灰霉病病菌區(qū)系和灰葡萄孢菌多樣性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 張蕾;灰葡萄孢菌菌株CanBc-1生物學(xué)特性及其致病力衰退機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王驥;田間抗啶酰菌胺灰葡萄孢菌生物學(xué)性質(zhì)研究及抗性治理藥劑研發(fā)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 馮會(huì)強(qiáng);灰葡萄孢菌隔膜蛋白septin的生物學(xué)功能解析[D];吉林大學(xué);2017年

3 龍瑞敏;松材線蟲移行的研究和灰葡萄孢菌液中活性物質(zhì)的提取及其對松材線蟲的誘引[D];廈門大學(xué);2007年

4 韓威;灰葡萄孢菌核形成相關(guān)基因功能的初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

5 趙悅;橘黃酮的提取及其抑菌特性的研究[D];大連工業(yè)大學(xué);2016年

6 任杰;擬南芥Mic60基因在灰霉菌抗性中與JA/ET信號(hào)通路的關(guān)系研究[D];云南農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

7 哈斯格根;中草藥提取物對番茄采后主要病原真菌的抑制作用和機(jī)理的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

8 王蓓;河西走廊鹽堿土中放線菌對幾株植物病原真菌拮抗作用的篩選研究[D];西北師范大學(xué);2014年

9 武東霞;灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）對苯噻菌酯和咯菌腈的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 張娜娜;肉桂醛對番茄采后灰霉病的抑制作用及其生理品質(zhì)的影響[D];上海師范大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2658742