發(fā)布時間：2020-04-27 09:25

【摘要】：小麥赤霉病因嚴重威脅小麥的產(chǎn)量品質(zhì),阻礙小麥生產(chǎn)的穩(wěn)步發(fā)展,受到世界的廣泛關(guān)注。禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)是引起小麥赤霉病的重要病原之一,其產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)嚴重威脅人畜的健康。許多酶或者非酶的機制可以有效清除活性氧,其中較為重要的機制是包含硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase,TRR)的硫氧還蛋白系統(tǒng)。硫氧還蛋白系統(tǒng)具有強烈的抗氧化和清除自由基的作用。目前已知,硫氧還蛋白還原酶在氧化型和還原型硫氧還蛋白的循環(huán)中起著關(guān)鍵作用,但其在植物病原真菌中的具體機制尚不清楚。在禾谷鐮刀菌基因組中有一個硫氧還蛋白還原酶基因,命名為FgTRR。構(gòu)建定位菌株發(fā)現(xiàn)FgTRR定位于細胞質(zhì)中。通過與稻瘟病菌、釀酒酵母和煙曲霉的TRR基因進行序列比對發(fā)現(xiàn),FgTRR具有FAD-binding domainⅠ(GXGXX,X為任意氨基酸)、FAD-binding domainⅡ(GXFAXGDV)和NADPH-binding domain(GGGXXA)等硫氧還蛋白還原酶家族典型的結(jié)構(gòu)域;通過進化樹比對發(fā)現(xiàn)FgTRR的親緣關(guān)系同物種進化趨勢基本一致。利用split-marker PCR的方法對TRR基因進行敲除,通過PCR水平和Southern blot水平的驗證得到7個?TRR突變體。對?TRR突變體的生物學(xué)表型研究發(fā)現(xiàn):與野生型菌株相比,?TRR突變體的菌絲生長速度明顯減慢,對分生孢子的形態(tài)沒有影響,但表現(xiàn)出產(chǎn)孢量下降和萌發(fā)延遲的現(xiàn)象,表明FgTRR在菌絲生長和分生孢子萌發(fā)中存在缺陷;與野生型菌株產(chǎn)生正常的子囊殼以及子囊不同,?TRR突變體產(chǎn)生的子囊殼形態(tài)較小且不能產(chǎn)生子囊和子囊孢子,進一步對有性生殖進行研究發(fā)現(xiàn),?TRR突變體表現(xiàn)出雌性不育的現(xiàn)象,這些結(jié)果表明FgTRR雖不是有性生殖所必須,但嚴重影響有性生殖過程;?TRR突變體在0.7 M KCl、0.7 M NaCl、1 M山梨醇和0.2 g/L剛果紅中表現(xiàn)出抗性減弱,在0.05%SDS中表現(xiàn)出抗性增強,表明FgTRR參與禾谷鐮刀菌的鹽脅迫、細胞壁和細胞膜的完整性;?TRR突變體在5 mM H_2O_2和15μM甲萘醌中表現(xiàn)出敏感性增強,抗性減弱的現(xiàn)象,表明FgTRR影響氧脅迫過程;?TRR突變體在色素積累方面存在缺陷,色素生物合成相關(guān)基因的表達水平顯著降低;與野生型相比,?TRR突變體致病性下降94%,侵染小麥和玉米須的能力減弱,DON毒素的產(chǎn)量顯著下降,DON毒素生物合成相關(guān)基因的表達量下降顯著,表明FgTRR在致病性方面至關(guān)重要;用5 mM H_2O_2處理1 h后,野生型菌株和?TRR突變體的原生質(zhì)體均表現(xiàn)出質(zhì)膜的磷脂酰絲氨酸外翻,發(fā)生外翻的原生質(zhì)體的比例分別為18%和33%,而在未經(jīng)H_2O_2處理的?TRR突變體中V-FITC陽性原生質(zhì)體的數(shù)量同樣多于野生型菌株,對菌絲細胞內(nèi)活性氧進行檢測發(fā)現(xiàn)?TRR突變體中活性氧積累多于野生型菌株,上述結(jié)果表明FgTRR參與細胞凋亡過程。綜上所述,本研究證明FgTRR在生長發(fā)育、有性生殖、色素合成、致病性和細胞凋亡等方面發(fā)揮重要的作用。
【圖文】：

圖 1 禾谷鐮刀菌 FgTRR 序列比對和進化樹分析A）禾谷鐮刀菌、釀酒酵母、稻瘟病菌和構(gòu)巢曲霉 TRR 保守結(jié)構(gòu)域的序列比對 （B）禾谷鐮刀菌 FgTRR 和其它菌 TRR 進化樹分析Fig. 1 Alignment and phylogenetic tree of TRR in F. graminearum.(A) Sequence alignment of FgTRR with other fungal TRRs. Fg, F. graminearum; Mo, M. oryzae; An, A. nidulans; Sc, cerevisiae. Bold asterisks, arrows, triangles, and rhombuses denote a FAD-binding domain Ⅰ(GXGXX), a redox-activysteine pair (CAVC), a NADPH-binding domain (GGGXXA), and a FAD-binding domain Ⅱ(GXFAXGDV), respectiv(B) Phylogenetic tree of TRR in F. graminearum、Arabidopsis thaliana and parts of fungi..2 FgTRR-GFP 的亞細胞定位為明確 FgTRR 的亞細胞定位情況，我們構(gòu)建了帶有自身啟動子的 FgTRR-GFP 重粒，隨后轉(zhuǎn)化得到亞細胞定位轉(zhuǎn)化子 6 個，熒光顯微鏡對其萌發(fā) 12 h 的菌絲初步觀現(xiàn)其熒光分布均勻。激光共聚焦顯微鏡對萌發(fā) 12 h 菌絲和分生孢子進行觀察，發(fā)現(xiàn)果同在熒光顯微鏡中一致。結(jié)果表明 FgTRR 在分生孢子和萌發(fā) 12 h 的菌絲中均定細胞質(zhì)中 (圖 2)。

圖 2 FgTRR-GFP 的亞細胞定位Fig. 2 Subcellular localization of the FgTRR-GFP fusion protein in F. graminearum. GFP signal observation in hyphae anconidia was determined using a laser confocal microscope. Bar = 10 μm.3.3 FgTRR 敲除突變體的獲得根據(jù)同源重組的原理，借助 PCR 擴增和 Split-marker PCR 的手段連接得到正確的除片段。通過制備野生型菌株原生質(zhì)體、PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 (Hou et al., 2002)抗性篩選，得到大約 350 個轉(zhuǎn)化子。為鑒定出插入正確的轉(zhuǎn)化子，提取部分轉(zhuǎn)化子基組 DNA，利用相應(yīng)引物進行驗證。其中 7 個轉(zhuǎn)化子通過 PCR 水平的驗證，表現(xiàn)出正的檢測結(jié)果，即無目的基因但同時具有上下游驗證序列 (圖 3)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S432.44

【參考文獻】

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本文編號：2642114