【摘要】：西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)引起的瓜類細(xì)菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是一種具有毀滅性的種傳病害,主要為害西瓜、甜瓜等葫蘆科作物。該病害的發(fā)生流行可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重制約了西瓜、甜瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。由于對該病菌的致病機(jī)理了解匱乏,目前尚缺乏行之有效的防控手段,解析西瓜噬酸菌的致病機(jī)制是解決病害防控問題的關(guān)鍵。眾所周知,由三型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system,T3SS)分泌的效應(yīng)蛋白(Type 3 effectors,T3Es)在植物病原細(xì)菌的致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,因此對效應(yīng)蛋白的篩選鑒定及功能研究有助于深入理解病原菌的致病機(jī)理。然而目前針對西瓜噬酸菌效應(yīng)蛋白的研究卻鮮有報道,故本試驗以西瓜噬酸菌Aac5為研究對象,利用生物信息學(xué)、煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)、Western blot、q RT-PCR等技術(shù)手段篩選鑒定西瓜噬酸菌的特異性效應(yīng)蛋白以及與效應(yīng)蛋白Avr Rpt2同源的假定效應(yīng)蛋白,并對兩者的生物學(xué)功能進(jìn)行初步分析,結(jié)果如下:1.假定效應(yīng)蛋白Ace0201的鑒定及生物學(xué)功能的初步分析生物信息學(xué)分析表明在西瓜噬酸菌中存在一個與效應(yīng)蛋白Avr Rpt2同源的假定蛋白Ace0201。q RT-PCR結(jié)果表明西瓜噬酸菌T3SS核心基因hrp G及hrp X調(diào)控其編碼基因ace0201的表達(dá);Western blot檢測結(jié)果進(jìn)一步證實Ace0201具有分泌功能且受到T3SS的調(diào)控,說明Ace0201是一個三型效應(yīng)蛋白。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Ace0201可以定位于煙草的細(xì)胞膜和細(xì)胞核,且具有抑制促細(xì)胞凋亡蛋白BAX誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)及抑制活性氧(Reactive oxygen species,ROS)爆發(fā)的功能特征,基因ace0201缺失后西瓜噬酸菌對天然寄主西瓜的致病能力增強(qiáng)。2.西瓜噬酸菌特異性效應(yīng)蛋白的篩選利用生物信息學(xué)軟件對西瓜噬酸菌的效應(yīng)蛋白進(jìn)行預(yù)測分析,獲得了31個候選特異性效應(yīng)蛋白;利用煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)對候選特異性效應(yīng)蛋白進(jìn)行進(jìn)一步篩選,結(jié)果成功獲得一個能夠抑制BAX誘導(dǎo)PCD反應(yīng)的候選效應(yīng)蛋白Ace1242,BLAST比對分析表明Ace1242與其他病原細(xì)菌的效應(yīng)蛋白不具有同源性,這些結(jié)果說明Ace1242具備抑制植物免疫反應(yīng)的功能特征,且可能為西瓜噬酸菌的特異性效應(yīng)蛋白。3.候選效應(yīng)蛋白Ace1242的鑒定及生物學(xué)功能的初步分析候選效應(yīng)蛋白Ace1242包含95個氨基酸,研究發(fā)現(xiàn)西瓜噬酸菌T3SS核心基因hrp G及hrp X調(diào)控其編碼基因ace1242的表達(dá),說明Ace1242受到T3SS的調(diào)控;致病性試驗結(jié)果表明,基因ace1242缺失后西瓜噬酸菌對天然寄主西瓜的致病能力顯著下降,說明Ace1242在病原菌的致病過程中行使著一定的功能;亞細(xì)胞定位的觀察結(jié)果表明Ace1242可以定位于煙草的細(xì)胞膜和細(xì)胞核;ROS的測定結(jié)果顯示Ace1242顯著抑制ROS的爆發(fā),表明Ace1242可以抑制煙草的PTI反應(yīng)。綜上,本研究在西瓜噬酸菌中成功鑒定了一個與Avr Rpt2同源的效應(yīng)蛋白Ace0201,并篩選鑒定到一個潛在的特異性效應(yīng)蛋白Ace1242,這兩個效應(yīng)蛋白都在西瓜噬酸菌的致病過程中發(fā)揮著一定作用。
【圖文】：

圖 1.1 果斑病在世界范圍內(nèi)的分布情況（Bahar et al., 2010）Fig.1.1 Distribution of BFB around the world（Bahar et al., 2010）

圖 1.2 西瓜噬酸菌的菌落形態(tài)及鞭毛形態(tài)ig.1.2 The colonial morphology and flagellar morphology of Acidovorax citr酸菌致病機(jī)理的研究現(xiàn)狀
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S432.42

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本文編號：2630383