發(fā)布時(shí)間：2020-04-05 04:05

【摘要】：地下害蟲蠐螬因其地下棲息、危害隱蔽,成為國內(nèi)外公認(rèn)的難以防治的重大害蟲。但用于蠐螬微生物防治中的制劑種類數(shù)量有限,亟需進(jìn)一步挖掘新的殺蟲菌株和基因資源。近期的研究表明,植物在受到生物及非生物脅迫時(shí),富集有益微生物應(yīng)對脅迫,植物受蠐螬危害后如何響應(yīng),對根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能有何影響?這些問題的闡明將有助于明晰“害蟲-植物-根際微生物”三者互作關(guān)系,為突破現(xiàn)有殺蟲菌株篩選模式、建立新型高效殺蟲菌株篩選體系奠定理論基礎(chǔ)。以暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)幼蟲、花生和根際細(xì)菌為研究對象,通過16S rRNA基因高通量測序和培養(yǎng)組學(xué)方法,分析田間條件下,蠐螬危害對花生根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能的影響。發(fā)現(xiàn)田間蠐螬取食導(dǎo)致花生根際細(xì)菌群落發(fā)生顯著變化,腸桿菌屬(Enterobacter spp.)、不動桿菌屬(Acinetobacter spp.)等的豐度增加;在根際分離到7株對鞘翅目害蟲有殺蟲活性的腸桿菌屬的菌株,且這些菌株對鱗翅目小菜蛾沒有殺蟲活性。主要研究結(jié)果如下:本研究建立了一種便于田間大規(guī)模取樣的根際土壤樣品保存方法,即在樣品中加入GTC緩沖液,室溫條件下保存1天,對利用16S rRNA基因測序分析根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析無顯著影響。田間條件下,蠐螬危害引起花生根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變。利用16S rRNA基因高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn):蠐螬處理后,芽胞桿菌屬(Bacillus spp.)、腸桿菌屬、不動桿菌屬等的豐度增加;蠐螬取食1 d和7 d,花生根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。宏基因組測序結(jié)果表明,蠐螬處理導(dǎo)致花生根際細(xì)菌的功能的顯著變化。利用培養(yǎng)組學(xué)及三代測序技術(shù),對蠐螬危害后花生根際可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了分離及初步鑒定。通過TSB等六種培養(yǎng)基培養(yǎng),共分離到43板(96孔板)混合菌株,共計(jì)4128孔混合菌株。利用Barcode標(biāo)記的方法,通過PacBio測序平臺對分離獲得的菌株進(jìn)行了16S rRNA全長基因測序,共獲得29823條序列,注釋到變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)4個(gè)門、泛菌屬(Pantoea)、腸桿菌屬(Enterobacter)等147個(gè)屬。蠐螬危害后花生根際可培養(yǎng)細(xì)菌中篩選到具有殺蟲活性的菌株。通過殺蟲生物活性測定,共篩選到7株對鞘翅目大猿葉甲(Colaphellus bowringi)有活性的菌株,初步鑒定為腸桿菌屬的菌株。未篩選到對鱗翅目小菜蛾(Plutella xylostella)有殺蟲活性的菌株。利用非靶向代謝組技術(shù)對花生根際代謝物進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,蠐螬處理后花生根部代謝物發(fā)生了顯著的變化。共確定了19個(gè)差異代謝物,其中菜油甾醇、豆甾醇、棕櫚酸等11個(gè)代謝物濃度上升,肌醇、蘋果酸等8個(gè)代謝物濃度降低。本研究明確了在田間條件下,蠐螬危害對花生根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能的影響,為闡明“地下害蟲蠐螬-花生-根際細(xì)菌”三者互作機(jī)制、挖掘植物根際殺蟲微生物資源奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

4注：圖中展示豐度在前 100 的 OTU。 a: 分離菌在豐度在前 100 的 OTU 中占 64%； b: 分離菌在 Bulgarelli et al.,發(fā)表數(shù)據(jù)中比例；c: 分離菌在 Schlaeppi et al.,發(fā)表數(shù)據(jù)中比例；d: 葉片中分離可培養(yǎng)細(xì)菌比例。外環(huán)的黑色正方形代表這類 OTU 中的菌被分離培養(yǎng)。圖 1-1 16S rRNA 基因擴(kuò)增子分析擬南芥（A. thaliana）根際細(xì)菌及可培養(yǎng)細(xì)菌的比例（Bai et al., 2015）Fig.1-1 16S rRNA gene amplicon analysis of Arabidopsis rhizosphere bacteriaand the proportion of cultivable （Bai et al., 2015）1.2.2.2 用于微生物組研究的樣品的保存微生物組研究受到許多因素的影響。如模板制備（Tian et al., 2017）、儲存條件（Flores et al.,2015）、擴(kuò)增引物（Klindworth et al., 2013）和測序技術(shù)（Tremblay et al., 2015）等，都會影響樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，導(dǎo)致對稀有分類群的分析不準(zhǔn)確。其中，影響微生物組分析的最基本

圖 3-1 宏基因組測序基本數(shù)據(jù)分析流程圖Fig.3-1 Metagenome sequencing basic data analysis flow chart因組提取、16S rRNA 基因檢測及質(zhì)控分析基因組提取試劑盒提取了花生根際土細(xì)菌總基因組，獲得基因組（圖 3-2）。Marker：DL15000；CK：對照組花生根際土；11-20：樣品編圖 3-2 部分根際土壤基因組提取結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S154.3;S435.652

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本文編號：2614512