【摘要】：辣椒疫霉Phytophthora capsici是一種土壤傳播的植物病原體,具有多種宿主。病原體在宿主植物感染過程中分泌大量效應(yīng)物,包括CRN、RxLR效應(yīng)物,但其在病原菌中的作用機理仍然大部分未知。為此,本研究對辣椒疫霉RxLR效應(yīng)因子及脫氫酶進行研究。辣椒疫霉侵染的作物主要包括辣椒、茄子、西紅柿、黃瓜等茄科作物,在全國各地都有發(fā)生的報道。疫霉病發(fā)病迅速,發(fā)病范圍大而廣,對蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)造成極大的損失和影響。目前辣椒疫霉卵菌的主要防治手段是化學(xué)防治以及抗病品種種植,由于化學(xué)防治方面藥劑單一,病原菌抗藥性增強,因此,卵菌蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)為篩選新的藥物靶點、設(shè)計低毒高效的殺菌藥物提供了理論依據(jù)。我們通過解析辣椒疫霉RxLR效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)進行致病機制及功能的研究,利用基因克隆,將目的基因RxLR98344構(gòu)建到pET28a載體上;采用最常用且效率高的原核表達系統(tǒng),大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主,IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達;通過鎳柱親和層析、凝膠過濾層析等技術(shù)進行蛋白純化;運用氣相擴散法坐滴法和懸滴法兩種方法篩選目的蛋白晶體;最后通過X-ray衍射進行數(shù)據(jù)的收集,并將得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)進行目的蛋白三維結(jié)構(gòu)的解析。硫胺素焦磷酸(ThDP)在植物或動物體內(nèi)常作為一種輔酶,幫助其受體蛋白催化和轉(zhuǎn)運底物,在生命體生長代謝過程中起著不可或缺的作用。PcUE1是在辣椒疫霉卵菌中首個發(fā)現(xiàn)的ThDP-依賴型酶。目前,我們已經(jīng)拿到了PcUE1的三級結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)特征表明PcUE1與其它菌體中的NAD~+依賴型醇脫氫酶具有較高的相似性。經(jīng)進一步分析發(fā)現(xiàn)PcUE1的三級結(jié)構(gòu)催化中心構(gòu)象與ThDP-依賴型酶的不同,此外PcUE1三級結(jié)構(gòu)中沒有看到NAD~+輔因子的結(jié)合。根據(jù)其三維結(jié)構(gòu)構(gòu)象及特點,我們推測了18種可能底物,并利用動力學(xué)紫外分光光度計及高效液相色譜進行酶活測定分析。主要研究結(jié)果如下:(1)從辣椒疫霉基因組SD33中克隆了RxLR98344的目的基因,RxLR98344效應(yīng)分子的N端包括RxLR-DEER保守區(qū),C端為效應(yīng)區(qū),符合RxLR效應(yīng)分子的序列特征。將RxLR98344克隆構(gòu)建到帶有His標簽的pET28a原核表達載體上,在大腸桿菌內(nèi)誘導(dǎo)進行大量表達;(2)RxLR98344蛋白經(jīng)鎳柱親和層析、陽離子交換層析和分子篩層析后,得到了較高純度且較均一的母體蛋白溶液和硒代蛋白溶液;通過氣相擴散坐滴法和懸滴法,采用Hampton結(jié)晶試劑盒進行蛋白晶體結(jié)晶條件的篩選,通過X-ray衍射得到分辨率為2.6?的RxLR98344母體蛋白數(shù)據(jù);硒代蛋白晶體正在進行進一步收集硒代數(shù)據(jù)。(3)RxLR98344不能引起本氏煙(Nicotiana benthamiana)的細胞死亡,不能夠引起HR反應(yīng)。RxLR98344分別與INF1、Bax、CRN4共表達結(jié)果表明,RxLR98344能夠抑制Bax,不能抑制INF1、CRN4引起的細胞壞死。(4)通過解析PcUE1突變體三維結(jié)構(gòu)以及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)其結(jié)合NAD~+輔因子。此外,根據(jù)其結(jié)構(gòu)構(gòu)象特點,我們預(yù)測了18種底物,并通過動力學(xué)紫外分光光度計及高效液相色譜進行了酶活測定分析。發(fā)現(xiàn)PcUE1可能作為NADH依賴型脫氫酶,參與氧化還原的可逆反應(yīng),并初步測定其還原底物為間硝基苯乙酮、對硝基苯乙酮。
【圖文】：

44 蛋白結(jié)構(gòu)解析及功能分析和 ThDP-依賴型酶活性研究4圖1 植物的防衛(wèi)系統(tǒng)“Z”字形模式圖 (Jones et al., 2006)Fig. 1 A zigzag model illustrates the quantitative output of the plant immune system.(Jones et al., 2006)目前的研究認為病原物與植物的互作可以概括為一個“Z”形的模式（圖1）。首先是植物細胞膜上的受體PRRs識別出病原MAMPs/PAMPs ，使基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)得以激發(fā)，防止病原物的侵入，即病原相關(guān)分子模式激發(fā)的免疫反應(yīng)PAMP-Triggered Immunity (PTI)。而病原物進化泌出克服植物的防御機制的效應(yīng)蛋白，定位到植物細胞質(zhì)中破壞寄主的PTI反應(yīng)，使寄主感病。對于這種由效應(yīng)因子引起的免疫反應(yīng)，我們稱為觸發(fā)免疫Effector-Triggered Immunity(ETI)。ETI能夠使植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，，稱為過敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive cell death response, HR）。1.3 卵菌 RxLR 效應(yīng)因子的研究進展在植物與病原菌長期的相互競爭中，植物已經(jīng)進化出了能夠識別效應(yīng)物的抗性（R）蛋白，以抵御病原菌的侵染。植物的抗病過程是多種多樣的（Hiller et al.

性細胞死亡。因此分泌效應(yīng)蛋白的主要功能是抑制介導(dǎo)植物防御反應(yīng)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Win et al.，2007; Bhattacharjee et al.，2006; Nunes et al.，2007）。圖2 卵菌 RxLR 效應(yīng)蛋白作用模式圖（Sanju and Thakur, 2014）Fig. 2 Action map of oomycete RxLR effectors ( Sanju and Thakur, 2014)RxLR 和 CRN 效應(yīng)物的功能分析（圖 2）。RxLR 區(qū)域在分泌和靶向中起作用并且C 端區(qū)域攜帶效應(yīng)活性并在植物細胞內(nèi)進行操作。CRN 是具有由 C-末端區(qū)域編碼的效應(yīng)物活性的模塊化蛋白質(zhì)。1.3.2 RxLR 效應(yīng)因子的種類迄今為止報道了六種卵菌無毒效應(yīng)物：來自大豆病原體大豆疫霉菌（Phytophthorasojae）的 Avr1b; ATR1 和 ATR13 擬南芥病原菌透明粘蟲;和 Avr3a，Avr4 和 Avr1b 來自馬鈴薯和番茄病原體致病疫霉。所有上述六種蛋白質(zhì)都具有 RXLR 基序，該基序自那以來就被證明是效應(yīng)子 Avr3a 和 Avr1b 穿過植物宿主細胞質(zhì)膜所必需的（Boutemy et al.,2011; Yaeno et al., 2011; Maqbool et al., 2016; Chou et al., 2011; Sun et al., 2012; Leonelliet al., 2011）。來自致病疫霉的 RxLR 效應(yīng)分子 Avr3a 最初是無毒效應(yīng)因子，由馬鈴薯中相應(yīng)的抗性蛋白質(zhì) R3a 識別。Avr3aKI但不是 Avr3aEM激活馬鈴薯抗性蛋白 R3a 以觸發(fā)效應(yīng)子觸發(fā)免疫（ETI）。另外，這兩種形式都能夠抑制由致病疫霉素誘導(dǎo)素感染素1（INF1）誘導(dǎo)的宿主細胞死亡，在沒有 R3a 的情況下。Avr3aKI表現(xiàn)出更強的抑制作用，而 Avr3aEM抑制作用相對較弱（Sohn et al., 2007; Bos et al., 2006; Dou et al., 2008b）。除了 RxLR 效應(yīng)因子之外，卵菌還分泌另一類稱為'Crinkler's（CRN's）蛋白質(zhì)的細胞質(zhì)效
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S432.44

【參考文獻】

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