【摘要】：當(dāng)今世界,科技發(fā)展日新月異,科技的進(jìn)步帶動(dòng)現(xiàn)代生物技術(shù)的大發(fā)展,其中轉(zhuǎn)基因技術(shù)又被稱之為人類歷史上具有飛躍性進(jìn)步的第二次“綠色革命”。轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是在作物原有基因的基礎(chǔ)上引入外源基因,改造其遺傳物質(zhì),使其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生物性狀更好的滿足人類的需要。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)把蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis Bt)轉(zhuǎn)入到小麥體內(nèi),目的主要是增加小麥的抗蟲性,其中蘇云金芽孢桿菌的δ-內(nèi)毒素基因是小麥獲得抗蟲性能的最主要原因。但是轉(zhuǎn)基因技術(shù)也存在一定的生物安全性問(wèn)題,所以世界各國(guó)不斷加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管力度與檢測(cè)手段的研發(fā)。本論文應(yīng)用標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)(BHQ-1)的單鏈DNA(triplex-forming oligonucleotides TFO)和兩端同時(shí)標(biāo)記熒光基團(tuán)(FAM-6)的單鏈DNA(Single DNA S-DNA)構(gòu)建三螺旋DNA分子信標(biāo),然后目標(biāo)DNA單鏈(Target DNA T-DNA)和三螺旋DNA分子信標(biāo)接觸,導(dǎo)致三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而引起熒光信號(hào)強(qiáng)度的改變,實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的靈敏檢測(cè)。主要內(nèi)容如下所示:弱酸性環(huán)境下自組裝三螺旋分子信標(biāo)用于轉(zhuǎn)基因作物中的目標(biāo)基因蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis Bt)靈敏檢測(cè);最近幾年,三螺旋分子信標(biāo)被廣泛用于轉(zhuǎn)基因作物的靈敏檢測(cè),其中包括T·A?T和C~+·G?C(?是Watson-Crick氫鍵,·是Hoogsteen氫鍵)等三螺旋結(jié)構(gòu)在內(nèi)的分子信標(biāo)是最為常用的。當(dāng)三螺旋分子信標(biāo)形成時(shí),含有嘧啶鏈(胸腺嘧啶T和胞嘧啶C的)的單鏈DNA(triplex-forming oligonucleotides,TFO)需要在弱酸性環(huán)境下首先質(zhì)子化后才能和雙鏈DNA的嘌呤鏈(A和G)結(jié)合形成穩(wěn)定的三螺旋分子信標(biāo),其中含有胞嘧啶C的DNA單鏈(TFO)質(zhì)子化后,帶正電的胞嘧啶C~+與帶負(fù)電的DNA雙鏈由于靜電作用,能夠起到穩(wěn)定三螺旋分子信標(biāo)的作用。目標(biāo)DNA單鏈加入后可以破壞三螺旋信標(biāo)的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的改變,實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的靈敏檢測(cè),檢測(cè)下限達(dá)到1 pM。中性環(huán)境下自組裝三螺旋分子信標(biāo)用于轉(zhuǎn)基因作物目標(biāo)基因蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis Bt)靈敏檢測(cè);為了擴(kuò)展三螺旋分子信標(biāo)的應(yīng)用范圍,在本論文中人為加入Ag~+用來(lái)增加三螺旋分子信標(biāo)在中性環(huán)境下的穩(wěn)定性。Ag~+不僅能夠特異性識(shí)別C·G?C的三螺旋結(jié)構(gòu),而且還可以把C~+·G?C中的H~+置換成Ag~+C·G?C新的三螺旋結(jié)構(gòu),這樣Ag~+的加入就極大的增加三螺旋分子信標(biāo)的應(yīng)用范圍。目標(biāo)DNA單鏈加入后可以破壞三螺旋信標(biāo)的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的改變,實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的靈敏檢測(cè),檢測(cè)下限達(dá)到0.1 pM。
【圖文】：

1100 萬(wàn) hm2(王宇，2014)。自轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展到今天，美國(guó)是世界上最早技術(shù)，也是商品化種植最多的國(guó)家。截止到 2015 年時(shí)，美國(guó)約 94%的棉花豆、92%的玉米均是轉(zhuǎn)基因作物。轉(zhuǎn)基因作物的種植也為美國(guó)農(nóng)業(yè)帶來(lái)了巨2017 年，我國(guó)的轉(zhuǎn)基因植物種植面積為達(dá)到 370 萬(wàn) hm2，主要是以木瓜、為主，但小麥、玉米、水稻、大豆等主要糧食作物未種植轉(zhuǎn)基因品種(Zhan)。從 20 世紀(jì) 80 年代中期的“十五”開始，我國(guó)就重點(diǎn)開展功能基因克隆心技術(shù)創(chuàng)新、新產(chǎn)品培育與產(chǎn)業(yè)化、轉(zhuǎn)基因新材料創(chuàng)新和轉(zhuǎn)基因作物安全性的研究(汪其懷，2017)，充分利用我國(guó)現(xiàn)有的資源和人才追趕世界發(fā)展腳步大突破和科技創(chuàng)新成果。目前，我國(guó)雖然實(shí)現(xiàn)主糧的基本自給，但農(nóng)產(chǎn)品缺口的大多數(shù)糧食作物均為轉(zhuǎn)基因作物，我國(guó)逐步成為轉(zhuǎn)基因糧食產(chǎn)品的消濤，2017)。

云金芽孢桿菌最早是 Ishiwata 在蠶蛾中發(fā)現(xiàn)的，后來(lái)又因在德國(guó)蘇云金省重命名。直到二十世紀(jì)五十年代人們才發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性是由該變成孢芽時(shí)產(chǎn)生的晶體蛋白造成的，因?yàn)檫@些晶體蛋白具有一定的殺蟲效果為殺蟲蛋白或者是蘇云金桿毒蛋白。蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因草地植株對(duì)多種抗性，而且食用該植株的棉鈴蟲幼蟲的死亡率高達(dá) 80%。轉(zhuǎn)蘇云金桿毒蛋白列 Cry1A 基因的棉花，不僅對(duì)鱗翅目類害蟲有高抗性，而且還同時(shí)對(duì)雙翅目具有抗性(Toshiyuki et al，，2011)。我國(guó)在 1991 年就研制出了轉(zhuǎn) Bt 基因的甘藍(lán)花等，其中我國(guó)第一代轉(zhuǎn) Bt 基因的抗蟲棉花的抗蟲性達(dá)到了 95%以上%-80%的農(nóng)藥用量，產(chǎn)量增加了 40%-50%。到現(xiàn)在為止，全球共有 60 多種轉(zhuǎn)植物，其中大多數(shù)應(yīng)用的蘇云金桿毒蛋白氨基酸序列是 Cry1，也有少部分是在我國(guó)研制成功的轉(zhuǎn) Bt 基因植物主要有馬鈴薯、水稻、番茄、玉米、大豆麥等。其中玉米和棉花已經(jīng)進(jìn)入大規(guī)模商業(yè)化推廣階段(張寶紅，2000）。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：O657.3;S188

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本文編號(hào)：2609185