【摘要】：當(dāng)今世界,科技發(fā)展日新月異,科技的進(jìn)步帶動現(xiàn)代生物技術(shù)的大發(fā)展,其中轉(zhuǎn)基因技術(shù)又被稱之為人類歷史上具有飛躍性進(jìn)步的第二次“綠色革命”。轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是在作物原有基因的基礎(chǔ)上引入外源基因,改造其遺傳物質(zhì),使其營養(yǎng)價值、生物性狀更好的滿足人類的需要。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)把蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis Bt)轉(zhuǎn)入到小麥體內(nèi),目的主要是增加小麥的抗蟲性,其中蘇云金芽孢桿菌的δ-內(nèi)毒素基因是小麥獲得抗蟲性能的最主要原因。但是轉(zhuǎn)基因技術(shù)也存在一定的生物安全性問題,所以世界各國不斷加強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管力度與檢測手段的研發(fā)。本論文應(yīng)用標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)(BHQ-1)的單鏈DNA(triplex-forming oligonucleotides TFO)和兩端同時標(biāo)記熒光基團(tuán)(FAM-6)的單鏈DNA(Single DNA S-DNA)構(gòu)建三螺旋DNA分子信標(biāo),然后目標(biāo)DNA單鏈(Target DNA T-DNA)和三螺旋DNA分子信標(biāo)接觸,導(dǎo)致三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而引起熒光信號強(qiáng)度的改變,實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因作物的靈敏檢測。主要內(nèi)容如下所示:弱酸性環(huán)境下自組裝三螺旋分子信標(biāo)用于轉(zhuǎn)基因作物中的目標(biāo)基因蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis Bt)靈敏檢測;最近幾年,三螺旋分子信標(biāo)被廣泛用于轉(zhuǎn)基因作物的靈敏檢測,其中包括T·A?T和C~+·G?C(?是Watson-Crick氫鍵,·是Hoogsteen氫鍵)等三螺旋結(jié)構(gòu)在內(nèi)的分子信標(biāo)是最為常用的。當(dāng)三螺旋分子信標(biāo)形成時,含有嘧啶鏈(胸腺嘧啶T和胞嘧啶C的)的單鏈DNA(triplex-forming oligonucleotides,TFO)需要在弱酸性環(huán)境下首先質(zhì)子化后才能和雙鏈DNA的嘌呤鏈(A和G)結(jié)合形成穩(wěn)定的三螺旋分子信標(biāo),其中含有胞嘧啶C的DNA單鏈(TFO)質(zhì)子化后,帶正電的胞嘧啶C~+與帶負(fù)電的DNA雙鏈由于靜電作用,能夠起到穩(wěn)定三螺旋分子信標(biāo)的作用。目標(biāo)DNA單鏈加入后可以破壞三螺旋信標(biāo)的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的改變,實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因作物的靈敏檢測,檢測下限達(dá)到1 pM。中性環(huán)境下自組裝三螺旋分子信標(biāo)用于轉(zhuǎn)基因作物目標(biāo)基因蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis Bt)靈敏檢測;為了擴(kuò)展三螺旋分子信標(biāo)的應(yīng)用范圍,在本論文中人為加入Ag~+用來增加三螺旋分子信標(biāo)在中性環(huán)境下的穩(wěn)定性。Ag~+不僅能夠特異性識別C·G?C的三螺旋結(jié)構(gòu),而且還可以把C~+·G?C中的H~+置換成Ag~+C·G?C新的三螺旋結(jié)構(gòu),這樣Ag~+的加入就極大的增加三螺旋分子信標(biāo)的應(yīng)用范圍。目標(biāo)DNA單鏈加入后可以破壞三螺旋信標(biāo)的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的改變,實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因作物的靈敏檢測,檢測下限達(dá)到0.1 pM。
【圖文】：

1100 萬 hm2(王宇，2014)。自轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展到今天，美國是世界上最早技術(shù)，也是商品化種植最多的國家。截止到 2015 年時，美國約 94%的棉花豆、92%的玉米均是轉(zhuǎn)基因作物。轉(zhuǎn)基因作物的種植也為美國農(nóng)業(yè)帶來了巨2017 年，我國的轉(zhuǎn)基因植物種植面積為達(dá)到 370 萬 hm2，主要是以木瓜、為主，但小麥、玉米、水稻、大豆等主要糧食作物未種植轉(zhuǎn)基因品種(Zhan)。從 20 世紀(jì) 80 年代中期的“十五”開始，我國就重點(diǎn)開展功能基因克隆心技術(shù)創(chuàng)新、新產(chǎn)品培育與產(chǎn)業(yè)化、轉(zhuǎn)基因新材料創(chuàng)新和轉(zhuǎn)基因作物安全性的研究(汪其懷，2017)，充分利用我國現(xiàn)有的資源和人才追趕世界發(fā)展腳步大突破和科技創(chuàng)新成果。目前，我國雖然實現(xiàn)主糧的基本自給，但農(nóng)產(chǎn)品缺口的大多數(shù)糧食作物均為轉(zhuǎn)基因作物，我國逐步成為轉(zhuǎn)基因糧食產(chǎn)品的消濤，2017)。

云金芽孢桿菌最早是 Ishiwata 在蠶蛾中發(fā)現(xiàn)的，后來又因在德國蘇云金省重命名。直到二十世紀(jì)五十年代人們才發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性是由該變成孢芽時產(chǎn)生的晶體蛋白造成的，因為這些晶體蛋白具有一定的殺蟲效果為殺蟲蛋白或者是蘇云金桿毒蛋白。蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因草地植株對多種抗性，而且食用該植株的棉鈴蟲幼蟲的死亡率高達(dá) 80%。轉(zhuǎn)蘇云金桿毒蛋白列 Cry1A 基因的棉花，不僅對鱗翅目類害蟲有高抗性，而且還同時對雙翅目具有抗性(Toshiyuki et al，，2011)。我國在 1991 年就研制出了轉(zhuǎn) Bt 基因的甘藍(lán)花等，其中我國第一代轉(zhuǎn) Bt 基因的抗蟲棉花的抗蟲性達(dá)到了 95%以上%-80%的農(nóng)藥用量，產(chǎn)量增加了 40%-50%。到現(xiàn)在為止，全球共有 60 多種轉(zhuǎn)植物，其中大多數(shù)應(yīng)用的蘇云金桿毒蛋白氨基酸序列是 Cry1，也有少部分是在我國研制成功的轉(zhuǎn) Bt 基因植物主要有馬鈴薯、水稻、番茄、玉米、大豆麥等。其中玉米和棉花已經(jīng)進(jìn)入大規(guī)模商業(yè)化推廣階段(張寶紅，2000）。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O657.3;S188

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本文編號：2609185