【摘要】：土壤鹽漬化是制約沿海防護林建設(shè)的重要因素之一。提高林木生產(chǎn)力和適逆性(特別是耐鹽能力)是進一步發(fā)揮林業(yè)生態(tài)和經(jīng)濟效益的重要舉措。利用傳統(tǒng)育種、細胞工程和基因工程技術(shù)提高植株耐鹽堿能力已取得一系列重要進展,然而,林木耐鹽性是由多個數(shù)量性狀基因控制的復雜性狀,且育種周期長。因此在林木耐鹽常規(guī)和分子育種研究中仍遇到了很大挑戰(zhàn)。根際共生菌對提高農(nóng)林植物生產(chǎn)力和適應性至關(guān)重要。根系非菌根真菌(non-mycorrhizal fungi,包括根際真菌和內(nèi)生真菌)就是一類普遍存在的能夠?qū)χ参锉硇秃蜕懋a(chǎn)生重要調(diào)控作用的微生物。但是,目前對非菌根真菌(特別在極端環(huán)境中)協(xié)同林木生長及耐鹽的潛力與機制的認識還十分有限。本論文在構(gòu)建豐富的林木非菌根真菌資源庫基礎(chǔ)上,以楊樹和楓香等重要沿海防護林樹種為研究對象,旨在研究非菌根真菌對苗木生長和耐性能力的調(diào)控效應并初步闡明可能的作用機制,最后對林木根部菌劑接種方法進行優(yōu)化。研究結(jié)果為創(chuàng)制新型植物促生、抗逆型接種劑奠定理論基礎(chǔ),為今后成果轉(zhuǎn)化和應用提供新的技術(shù)依據(jù)。本研究對浙江富陽、江蘇泗洪和河北威縣良種基地的楊樹以及多種灘涂鹽生植物的根系非菌根真菌進行分離培養(yǎng)。同時,依托于國內(nèi)外合作基礎(chǔ),搜集了多種根系內(nèi)生真菌資源。因此初步構(gòu)建了多生境、多宿主來源的根系非菌根真菌資源庫。以重要沿海防護林樹種毛白楊(Populus tomentosa)和美洲黑楊雜種優(yōu)良無性系NL-895楊(P.×euramericana cv.‘Nanlin895’,NL895)無性系無菌苗及北美楓香(Liquidambar styraciflua)的實生苗為研究對象,將供試菌株接種到上述苗木根系中,通過添加海鹽溶液篩選具有促生和耐鹽效應的菌株。主要研究結(jié)果如下:(1)供試菌株基礎(chǔ)生物學特性及功能初篩:選用45株真菌菌株,包括33株子囊菌(Ascomycota),4株擔子菌(Basidiomycota)與8株低等菌。主要類群有鐮刀菌屬(Fusarium)、格孢腔目(Pleosporales)、柔膜菌目(Helotiales)和被孢霉屬(Mortierella)等真菌。建立上述菌株與毛白楊和NL-895楊無性系無菌苗的共生體系,通過觀察楊樹幼苗接種后的表型變化(主要包括株高、根長和鮮重等指標)及根部細胞是否有侵染結(jié)構(gòu)形成,初步篩選具有潛在促生效應的功能菌株。(2)內(nèi)生彎孢霉菌株對毛白楊的促生、耐鹽效應:源自鹽生植物鹽地堿蓬(Suaeda salsa)健康植株根系的內(nèi)生彎孢霉(Curvularia sp.)菌株R2015-25可與毛白楊(P.tomentosa)順利建立共生體系并表現(xiàn)出顯著的促生效應。顯微觀察表明接種14 d后,R2015-25的菌絲可順利侵染定殖在毛白楊的根部并形成類似微菌核的侵染結(jié)構(gòu),在皮層細胞和根毛中可見念珠狀菌絲。說明該菌株可能屬于暗色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophyte,DSE)。盆栽試驗中,施加海鹽脅迫后,處理組楊樹的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)顯著高于對照組;葉綠素a、葉綠素b和脯氨酸(proline,Pro)含量也有所上升。處理組楊樹葉片光反應系統(tǒng)Ⅱ(photosystem II,PSⅡ)的電子傳遞效率(electron transport rate,ETR)、PSII實際光合效率Φ_(PSⅡ)及光化學淬滅值q P均顯著高于對照組。實驗結(jié)果表明,菌株R2015-25接種到毛白楊上可緩解宿主楊樹所受的鹽脅迫,這為極端環(huán)境內(nèi)生真菌資源提高林木耐鹽能力的應用提供了科學依據(jù)。(3)3株內(nèi)生鐮刀菌對北美楓香的促生、耐鹽效應:探討3株源于灘涂鹽堿地植物濱麥(Leymus mollis)的內(nèi)生鐮刀菌(Fusarium spp.)對北美楓香幼苗生長和耐鹽性的調(diào)控效應。結(jié)合形態(tài)學和分子系統(tǒng)學方法鑒定內(nèi)生鐮刀菌并體外檢測其毒素種類及含量。建立內(nèi)生鐮刀菌與無菌北美楓香實生幼苗共培養(yǎng)體系;利用臺盼藍染色觀察菌株在根系組織中形成的侵染結(jié)構(gòu);在正常和鹽脅迫條件下,研究內(nèi)生鐮刀菌對幼苗生長和耐鹽性的影響。3個菌株分別為黃色鐮刀菌(F.culmorum,Class2-1B)、假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum,Class2-1C)和一株未鑒定到種的鐮刀菌(Fusarium sp.,Class2-3)。Class2-1B和Class2-1C對北美楓香幼苗具有促生和協(xié)助耐鹽的作用,而Class2-3顯現(xiàn)出致病性。(4)內(nèi)生鐮刀菌重測序與碳代謝分析:以同種或相近種鐮刀菌的全基因組序列為參考,對3株鹽生植物內(nèi)生鐮刀菌(Class2-1B、Class2-1C和SYC-Root-1)進行全基因組重測序分析,并對重測序數(shù)據(jù)進行初步統(tǒng)計分析。采用BIOLOG真菌板比較分析3株內(nèi)生鐮刀菌的碳代謝活性,以期進一步揭示3株鐮刀菌的生理生態(tài)學特性。(5)內(nèi)生鐮刀菌及彎孢霉GFP轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建:為深入研究三株功能菌株彎孢霉(Curvularia sp.)、黃色鐮刀菌(F.culmorum)和假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum)在林木根系的侵染定殖特征以及跟蹤菌株在大田實驗中的實際侵染效率,利用根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,ATMT)獲得綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標記的三株菌株。將獲得的標記菌株接種至楊樹幼苗根系共培養(yǎng)14 d以上。熒光顯微觀察表明,三株功能菌株的菌絲可在楊樹幼苗根系成功侵染定殖。該研究體系為后期有效跟蹤檢測功能菌株的生態(tài)學特征奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
【圖文】：

過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法獲得菌種資源庫，，再結(jié)合接種方法來驗證菌株的功能。然而這究策略通常比較耗時費力，更重要的是不能全面反映根際微生物群落對宿主表型和的調(diào)控效應。近年來，以根系為誘餌、通過宿主表型來推測菌群功能的反向“釣魚”策經(jīng)在少數(shù)幾種草本植物中開展（Mueller and Sachs 2015; Niu et al., 2017; Pankebuissel., 2014），被認為是根際微生物組工程未來的重要研究方向。建立樹木-微生物群落互型，將加深認識多元土壤微生物群落對林木生產(chǎn)力和適應性的耦合機制�？傊�，通向和反向篩選策略、重組根際功能菌群，有望為今后創(chuàng)制新型菌劑、應用于高效育林木抗性育種等方面提供新的思路。

1.2.2.4 GFP 轉(zhuǎn)化利用根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT）獲得綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）標記的 3 株菌株：彎孢霉（Curvularia sp.）R2015-25、黃色鐮刀菌（F. culmorum）Class2-1B 和假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum）Class2-1C，觀察上述菌株在楊樹根系的侵染結(jié)構(gòu)。1.3 研究技術(shù)路線本研究技術(shù)路線詳見圖 1-2。
【學位授予單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S727.2;S714

【參考文獻】

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本文編號：2602111