【摘要】：細胞自噬途徑是真核生物高度保守的一類亞細胞降解途徑,通過自噬體的形成降解大分子蛋白質(zhì)和細胞器,維持細胞內(nèi)生理平衡和幫助細胞度過逆境。到目前為止,在釀酒酵母中已經(jīng)有38個細胞自噬相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn),并且大多數(shù)Atg蛋白的生物學(xué)特性也得到了研究闡述。但在禾谷鐮刀菌中,僅FgATG8和FgATG15被研究報道,其余ATG基因的生物學(xué)特性和功能均未見研究報道。本文通過同源比對共鑒定到28個自噬相關(guān)基因ATGs,并初步闡明了這些基因在禾谷鐮刀菌的營養(yǎng)生長、無性和有性生殖以及對小麥致病性和毒力中的作用,并以FgATG1、FgATG5和FgATG20為重點研究了其在禾谷鐮刀菌細胞自噬途徑中的生物學(xué)功能,主要研究結(jié)果如下:1.通過同源比對,在禾谷鐮刀菌基因組中共鑒定了 28個ATG基因,并通過同源重組雙交換的方法獲得了這28個ATG基因的敲除突變體。根據(jù)在PDA平板上的生長速率與野生型菌株P(guān)H-1有無明顯差異,將這些突變體分為了兩組,組一的生長速率與野生型菌株P(guān)H-1相比有明顯差異,生長減慢;組二則與PH-1無明顯差異。同時,大部分突變體氣生菌絲相比于PH-1明顯減少,表明多數(shù)細胞自噬相關(guān)基因可以影響禾谷鐮刀菌的生長速率及氣生菌絲的生長。此外,發(fā)現(xiàn)多數(shù)突變體產(chǎn)孢量明顯下降,致病力明顯減弱(除△Fgata17之外),DON毒素產(chǎn)生量明顯下降。這些結(jié)果表明細胞自噬對禾谷鐮刀菌營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢、致病性和DON毒素產(chǎn)生是必需的。2.對禾谷鐮刀菌FgATG1和FgATG5的生物學(xué)功能作了進一步的研究。FgATG1和FgATG5可分別恢復(fù)稻瘟病菌△Moatg1和△Moatg5突變體在營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢和致病方面的缺陷。禾谷鐮刀菌突變體△Fgatg1和△Fgatg5不能產(chǎn)生子囊殼和子囊,在N饑餓誘導(dǎo)條件下不能產(chǎn)生自噬小體,且激光共聚焦顯示GFP-FgAtg8蛋白的液泡轉(zhuǎn)運受阻,Western blot實驗發(fā)現(xiàn)FgAtg8隨自噬體的降解過程受抑制。點突變分析發(fā)現(xiàn),K53、D213和T228位點突變?yōu)楸彼釙r,菌落形態(tài)與敲除突變體△Fgatg1一致。上述結(jié)果表明,FgATG1和FgATG5在分子生物學(xué)功能上相對保守,兩者對禾谷鐮刀菌的有性生殖十分重要,同時參與其細胞自噬過程中自噬小體的形成,且對FgAtg8正常的轉(zhuǎn)運和降解是必要的,此外,K53、D213和T228位點是FgAtg1蛋白的三個關(guān)鍵氨基酸位點。3.在28個ATG基因的敲除突變體中,△Fgatg20和△Fgatg24突變體的菌落形態(tài)非常相似,但不同于其余突變體,且結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)FgAtg20與FgAtg24蛋白含有相同結(jié)構(gòu)域,因此,本文選取△Fgatg20為代表,重點研究了FgATG20基因的生物學(xué)特性與功能,取得以下結(jié)果:(1)突變體△Fgatg20生長速率明顯減慢,氣生菌絲稀少,幾乎不產(chǎn)生分生孢子,但能夠正常產(chǎn)生子囊殼、子囊和子囊孢子,致病力減弱。(2)缺失FgAtg20蛋白的PX結(jié)構(gòu)域后,生長表型和致病力與突變體△Fgag20類似。(3)FgAtg20-RFP蛋白的亞細胞定位呈現(xiàn)細胞質(zhì)中的點狀分布,且FgAtg20-RFP與GFP-FgAtg8共定位。(4)透射電鏡發(fā)現(xiàn)在N饑餓誘導(dǎo)條件下突變體△F△Fgatg20的菌絲細胞的液泡中無自噬小體產(chǎn)生。(5)發(fā)現(xiàn)突變體△Fgatg20中FgApell-RFP彌散于細胞質(zhì)中,而PH-1中FgApel-RFP在細胞質(zhì)中呈點狀分布,同時突變體中FgApel前體的成熟被抑制。(6)Western blot實驗證實突變體△Fgatg20中線粒體自噬標(biāo)記蛋白Porin的降解與PH-1無差異,且共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示在PH-1和△Fgatg20中MitoFluor-Red染色后的線粒體均能夠與CMAC標(biāo)記后的液泡融合。(7)經(jīng)Western blot實驗證實,突變體△Fgatg20中過氧化物酶體自噬標(biāo)記蛋白Pex14的降解被抑制。(8)酵母雙雜交實驗表明FgAtg24,FgAtg17和FgAtgll 均與 FgAtg20互作,FgAtgl 與FgAtg17互作,且也與FgAtg24互作,但不與FgAtg20直接互作,也不與FgAtgll互作。綜合上述結(jié)果表明,FgATG20參與禾谷鐮刀菌的營養(yǎng)生長、無性生殖和致病過程,PX結(jié)構(gòu)域?qū)gAtg20蛋白功能十分重要。FgATG20對自噬小體的形成是必需的,該基因參與禾谷鐮刀菌中的非選擇性宏自噬過程和過氧化物酶體自噬過程,但不影響線粒體自噬過程。FgAtg20蛋白與FgAtgl,FgAtgll,FgAtg17和FgAtg24形成一個多聚體,共同參與禾谷鐮刀菌中的細胞自噬過程。本研究結(jié)果表明,細胞自噬參與禾谷鐮刀菌的營養(yǎng)生長、生殖和致病過程,自噬蛋白之間相互作用共同參與調(diào)控禾谷鐮刀菌中的細胞自噬過程。此外,在禾谷鐮刀菌中除了細胞自噬途徑受TOR信號通路調(diào)控之外,FgHLTF1也受到TOR信號通路調(diào)控,是TOR信號通路下游的一個轉(zhuǎn)錄因子,對其進行分子生物學(xué)功能分析研究發(fā)現(xiàn),FgHltfl定位于細胞核中,同時FgHLTF1基因缺失后,相應(yīng)的突變體生長明顯減慢,色素明顯減少,不能產(chǎn)生子囊殼,不能正常侵染麥穗;但是突變體產(chǎn)生DON毒素的量相比于野生型沒有下降,且產(chǎn)生分生孢子的數(shù)量與野生型相比沒有明顯差異;突變體在添加了 1M Sorbitol、KC1和NaC1的CM平板上生長明顯受到抑制,同時0.7MNaCl處理2小時后,FgHog1不能響應(yīng)滲透脅迫從而進入到細胞核中。這些結(jié)果表明FgHLTF1基因在禾谷鐮刀菌的營養(yǎng)生長、有性生殖和致病性中起重要作用,同時參與了 HOG信號通路,但不參與DON毒素產(chǎn)生和無性生殖過程。
【圖文】：

圖１．丨禾谷鐮刀菌

第一章文獻綜述逡逑}卞義賢跡保坦攘毒�。１－分生孢子梗及分生孢讬巡－子你灎砍－讬血邋４－子囊孢讬穴董晋冝主辶x媳唷杜┮抵參鋝±硌А罰╁義希疲椋紓酰潁邋澹保卞澹疲酰螅幔潁椋酰恚紓潁幔恚椋睿澹幔潁酰恚澹保茫錚睿椋洌椋錚穡瑁錚潁邋澹幔睿溴澹悖錚睿椋洌椋幔澹玻校澹潁椋簦瑁澹悖椋酰恚澹常粒螅悖酰螅義希矗粒螅悖錚螅穡錚潁邋澹ǎ模錚睿紓�，邋Ａ＜倽}椋悖酰歟簦酰潁幔戾澹穡瑁簦錚穡幔簦瑁錚歟錚紓╁義蝦坦攘毒ǎ棋危┚可さ淖釷飾露確段玻玻玻

本文編號：2600905