【摘要】：蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)Cry2類(lèi)蛋白對(duì)多種鱗翅目害蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性,并且與目前廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物中的Cry1類(lèi)蛋白無(wú)交互抗性,是轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物重要的候選蛋白。目前,獲得命名的cry2類(lèi)基因共有94個(gè),分為13類(lèi)模式基因(cry2Aa-cry2Al,cry2Ba)。Cry2類(lèi)蛋白具有序列相似性高,但是殺蟲(chóng)活性、殺蟲(chóng)譜及蛋白表達(dá)差異較大的特點(diǎn)。本研究重點(diǎn)圍繞cry2類(lèi)基因的表達(dá)特性開(kāi)展研究,分析誘導(dǎo)溫度、氨基酸序列差異、分子伴侶等因素對(duì)Cry2類(lèi)蛋白表達(dá)的影響。具體包括本實(shí)驗(yàn)室克隆的五種模式的7個(gè)cry2類(lèi)基因(cry2Aa9、cry2Aa17、cry2Ab4、cry2Ab29、cry2Ad2、cry2Ba2、cry2Ah1),分別在大腸桿菌(Escherichia coli)和蘇云金芽胞桿菌中進(jìn)行了不同條件的表達(dá),主要進(jìn)展如下:1.分析了相同誘導(dǎo)條件下,不同cry2類(lèi)基因在大腸桿菌中的表達(dá)情況。分別比較了20℃和30℃誘導(dǎo)下Cry2類(lèi)蛋白表達(dá)量差異。其中Cry2Ah1蛋白的表達(dá)量均最高。通過(guò)比對(duì)Cry2Ah1蛋白與其它蛋白的氨基酸序列及三維結(jié)構(gòu)差異,發(fā)現(xiàn)Cry2Ah1蛋白位于DomainⅡβ4與β5之間loop上的第355位缺失了1個(gè)氨基酸。對(duì)Cry2Ah1蛋白的增加氨基酸突變體Cry2Ahs(354位v變?yōu)閟,355位添加p)、Cry2Ahv(355位添加p)進(jìn)行相同條件誘導(dǎo)表達(dá),這兩種突變體的蛋白表達(dá)量顯著低于Cry2Ah1蛋白,從而證實(shí)了Cry2類(lèi)蛋白表達(dá)量與DomainⅡβ4與β5之間loop上的氨基酸數(shù)量密切相關(guān)。2.比較了在不同溫度誘導(dǎo)下,在大腸桿菌中表達(dá)的7種Cry2類(lèi)蛋白對(duì)甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的殺蟲(chóng)活性,其中Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1四種蛋白對(duì)甜菜夜蛾有活性。在20℃誘導(dǎo)的條件下,蛋白濃度為100μg/mL時(shí),Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1蛋白對(duì)甜菜夜蛾的體重抑制活性分別為42.74%、89.18%、87.02%、85.28%;在30℃誘導(dǎo)的條件下,蛋白濃度為100μg/mL時(shí),Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1蛋白對(duì)甜菜夜蛾的體重抑制活性分別為0、43.72%、47.48%、70.54%;結(jié)果表明Cry2類(lèi)蛋白的活性受溫度影響,且Cry2Ah1蛋白的活性受溫度影響較小。3.對(duì)實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的Cry2Aa蛋白Bt表達(dá)載體pHT315-cry2AΔo1進(jìn)行了改造。通過(guò)定點(diǎn)突變的方法將ClaⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)引入cry2Aa基因兩端,利用同源重組的方法構(gòu)建9種cry2類(lèi)基因的Bt重組表達(dá)載體;導(dǎo)入Bt HD73~-無(wú)晶體突變株后,9種蛋白均獲得表達(dá)。比較了各重組菌對(duì)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)、小菜蛾(Plutella xylostella)、東方粘蟲(chóng)(Mythimna separata)、亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的生物活性,除Cry2Aa9重組菌有活性外,其它重組菌均無(wú)明顯活性。4.比較了Bt表達(dá)載體中分子伴侶ORF1、ORF2對(duì)Cry2類(lèi)蛋白表達(dá)量及蛋白溶解性的影響。在分子伴侶ORF1、ORF2同時(shí)存在的情況下,Cry2類(lèi)蛋白表達(dá)量顯著高于ORF2單獨(dú)存在,但是ORF1、ORF2同時(shí)存在對(duì)Cry2類(lèi)蛋白在堿性溶液中的溶解性無(wú)顯著影響。此進(jìn)展為進(jìn)一步改造Cry2類(lèi)蛋白序列、提高蛋白表達(dá)及殺蟲(chóng)活性奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

1.1.1 蘇云金芽胞桿菌概述蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，屬于蠟樣芽胞桿菌族，與其它芽胞桿菌的主要區(qū)別是在芽胞形成過(guò)程中產(chǎn)生不同形狀的伴胞晶體蛋白（圖1.1）（Didelot, etal., 2009; Schnepf, et al., 1998）。Bt是一種廣泛分布于自然界中的土壤、水域、植物落葉、苔蘚及昆蟲(chóng)的尸體中的昆蟲(chóng)病原菌（Reyaz, et al., 2016; Zhang, et al., 2007），其殺蟲(chóng)活性主要與伴胞晶體有關(guān)，它是目前防治農(nóng)業(yè)、林業(yè)以及公共衛(wèi)生害蟲(chóng)的最成功的微生物殺蟲(chóng)劑（Deist, et al., 2014;Zhang, et al., 2016）。伴胞晶體是細(xì)菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定期時(shí)產(chǎn)生的晶體狀物質(zhì)，又稱(chēng)殺蟲(chóng)晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins, ICPs）,包括Cry蛋白和Cyt蛋白（Schnepf, et al., 1998; vanFrankenhuyzen, 2009）。圖1.1 蘇云金芽胞桿菌SWK1菌株的芽胞和晶體Figure 1.1 Spores and crystals of Bt strain SWK1 (Reyaz, et al., 2016)1.1.2 蘇云金芽胞桿菌的分類(lèi)自 20 世紀(jì)初從家蠶（Bombyx mori）中分離得到第一株長(zhǎng)桿狀、有芽胞形成的菌株后，相繼從世界各地分離得到一些形態(tài)特征相似、能形成伴胞晶體的芽胞桿菌，各種分類(lèi)方法也隨即產(chǎn)生（關(guān)雄，2006）。最初，研究者們根據(jù) Bt 的形態(tài)特征和生化特性來(lái)鑒別不同亞種

蛋白蛋白的分類(lèi)，H fte 等人根據(jù)內(nèi)毒素氨基序列同源性以及殺蟲(chóng)活性的相似性將 Cry 蛋種類(lèi)加羅馬數(shù)字表示，對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)有活性的為 CryⅠ類(lèi)蛋白，對(duì)鱗翅目和劃分為 CryⅡ類(lèi)蛋白，對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)有活性的屬于 CryⅢ類(lèi)蛋白，CryIV 是的蛋白（H fte, et al., 1989）。隨著新基因不斷被發(fā)掘，發(fā)現(xiàn)一些毒素殺蟲(chóng)差別很大；有的序列同源性很高、殺蟲(chóng)活性卻大不相同。為了克服這一re 等人開(kāi)發(fā)了一種新的分類(lèi)方案。根據(jù)該方案，Bt -內(nèi)毒素命名委員會(huì)僅劃分。蛋白質(zhì)名稱(chēng)主要由兩部分組成，第一部分是蛋白質(zhì)的種類(lèi)及性質(zhì)，不同等級(jí)，將毒素劃分為四個(gè)等級(jí)（圖 1.2），1、4 等級(jí)由阿拉伯?dāng)?shù)字表寫(xiě)英文字母和小寫(xiě)英文字母表示，四個(gè)等級(jí)劃分是分別以序列相似性 45%rickmore, et al., 1998）。截至 2019 年 3 月，812 個(gè) cry 基因被國(guó)際命名委員8 個(gè)基因家族。（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S476.1

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