【摘要】：蚜蟲是世界上分布最廣、危害最嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)害蟲之一。大部分蚜蟲在受到天敵攻擊時都會從腹管釋放報警信息素,以警告同種個體潛在的威脅,而該行為對于蚜蟲的綜合治理具有重要意義。許多蚜蟲的報警信息素的主要成分是倍半萜烯(E)-β-farnesene(EβF)。迄今,蚜蟲EβF生物合成的機制尚不清楚。本文采用多種研究手段,對蚜蟲EβF生物合成的來源和候選基因的功能進(jìn)行了較為全面的分析,結(jié)果如下:1.對蚜蟲EβF生物合成的可能來源(寄主植物、體內(nèi)共生菌和蚜蟲自身)進(jìn)行了鑒別。首先采用全人工飼料喂養(yǎng)桃蚜和棉蚜,GC-MS分析發(fā)現(xiàn)蚜蟲仍然能夠釋放EβF,這就排除了寄主植物作為EβF生物合成來源的可能性;另一方面,在飼料里面添加抗生素以除去蚜蟲體內(nèi)共生菌Buchnera,結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫共生的蚜蟲盡管不能產(chǎn)生后代,但仍能釋放EβF,這說明Buchnera也不是EβF生物合成的來源。綜上,EβF很可能是由蚜蟲自身合成的。2.對棉蚜體內(nèi)Buchnera的ispA基因進(jìn)行了功能鑒定。通過比較脫共生的棉蚜與在植物上喂養(yǎng)的棉蚜EβF濃度(ng/mg蚜蟲),發(fā)現(xiàn)脫共生棉蚜所釋放EβF的濃度明顯降低,因此猜測其體內(nèi)Buchnera的ispA基因可能會為EβF的合成提供部分前體物質(zhì)FPP。該文對ispA基因進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)和體外酶活分析。結(jié)果表明,重組表達(dá)的ispA-GST可溶性蛋白在體外未能顯示合成FPP的活性,進(jìn)一步排除了 Buchnera參與蚜蟲EβF生物合成的可能性。3.比較測定了受刺激產(chǎn)生EβF后與未受刺激棉蚜兩組樣品的轉(zhuǎn)錄組。測序結(jié)果共獲得60,614個UniGene;差異表達(dá)基因分析顯示,分別有1201和729個UniGene上調(diào)和下調(diào)。GO富集分析發(fā)現(xiàn)代謝過程和生物過程、催化活性等條目被顯著激活;KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)氨基酸生物合成、谷胱甘肽代謝和溶酶體等通路出現(xiàn)明顯富集。對棉蚜類異戊二烯通路上的關(guān)鍵基因進(jìn)行了 qPCR分析,發(fā)現(xiàn)棉蚜在受到刺激產(chǎn)生液滴2h后,AgFPPS、AgGGPPS、AgDPPS以及Buchnera的ispA基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)不同情況的波動,其中AgFPPS和AgGGPPS基因的變化情況相似,且很可能與蚜蟲EβF的生物合成具有密切的關(guān)系。4.對棉蚜AgFPPS、AgGGPPS和AgDPPS基因進(jìn)行了 RNAi研究。結(jié)果表明,150ng/μL和250 ng/μL的dsAgFPPS和dsAgGGPPS在連續(xù)飼喂2 d的條件下,干擾效果最好;200 ng/μL的dsAgDPPS1和dsAgDPPS2在連續(xù)飼喂4d后可顯著抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)。上述4個基因被干擾后,對棉蚜生物學(xué)性狀沒有顯著影響,但AgFPPS基因被干擾后,蚜蟲所釋放EβF的濃度(ng/mg蚜蟲)與對照相比顯著下降,而AgGGPPS基因被干擾后,所釋放EβF的濃度與對照相比顯著上升;AgDPPS1和AgDPPS2基因被干擾后,對EβF濃度無顯著影響。該研究為蚜蟲FPPS基因與EβF生物合成之間的密切關(guān)系提供了第一個體內(nèi)實驗證據(jù)。5.對棉蚜AgFPPS基因進(jìn)行了原核表達(dá)和酶活分析,以進(jìn)一步探討AgFPPS基因和EβF生物合成的關(guān)系。構(gòu)建了 pET-28a(+)-97AgFPPS重組表達(dá)子,實現(xiàn)了 AgFPPS的可溶性表達(dá),并對該重組蛋白進(jìn)行了體外酶促反應(yīng)。通過GC-MS分析,發(fā)現(xiàn)該酶蛋白可催化合成GPP和FPP,證明AgFPPS具有GPPS/FPPS的雙重功能,但并未檢測到EβF的生成,證明在特定體外條件下AgFPPS不具有EβF合成酶的功能。綜上,該研究為FPPS和GGPPS基因與蚜蟲EβF生物合成之間的密切關(guān)系提供了第一個分子證據(jù)。本研究為蚜蟲EβF生物合成及其調(diào)控機制的研究奠定了扎實的基礎(chǔ),也可為蚜蟲的可持續(xù)控制提供新思路。
【圖文】：

�。卞澹恚滔♂專保氨叮诲义虾弦海喊矗玻氨读糠Q取以下Ｂ族維生素下順利進(jìn)行混合：氨基酸混合物＋蔗糖＋生素＋抗壞血酸微量元素螯合物０．５邋ｍＬ；逡逑上混合液用３０％邋ＫＯＨ調(diào)ｐＨ到７．０，接細(xì)菌過濾器，過濾除菌，在無菌室內(nèi)分方法逡逑的玻璃管（直徑２．５邋ｃｍ，高３．０邋ｃｍ），石蠟?zāi)�，用移液槍滴加人工飼料１５０－２００定要�?jīng)過紫外燈滅菌處理（高文興等，２，以免污染飼料。每個飼蚜器內(nèi)分別接封口，橡皮筋扎緊，防止蚜蟲逃逸。第二＿１：飼料。逡逑

２．３．３．５棉蚜體內(nèi)共生菌的去除逡逑棉蚜體內(nèi)共生菌也采取了相同的方法去除，，用不同抗生素采用不同飼喂方法均能使胞內(nèi)共生逡逑菌得到降解，同桃蚜一樣，采用飼喂和噴灑相結(jié)合的方法能較快去除其體內(nèi)共生菌（圖２－３）。逡逑２２逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S433.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2598707