【摘要】：十字花科蔬菜由于在長(zhǎng)久以來(lái)都作為我國(guó)人民食用的主要蔬菜,受到了人們?cè)谏a(chǎn)生活方面的重視。大猿葉甲作為鞘翅目代表昆蟲,是重要的危害十字花科作物的害蟲。由于十字花科蔬菜的大面積種植,大猿葉甲對(duì)其造成嚴(yán)重危害并使其大量減產(chǎn),造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一種革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌,目前在農(nóng)業(yè)害蟲防控方面已經(jīng)廣泛應(yīng)用Bt制劑,在對(duì)Bt資源的研究中發(fā)現(xiàn),分泌蛋白Sip對(duì)鞘翅目昆蟲(如大猿葉甲,CPB等)表現(xiàn)出極高的殺蟲活性,對(duì)害蟲的控制具有良好的應(yīng)用前景。而目前研究發(fā)現(xiàn),部分害蟲對(duì)Bt制劑也表現(xiàn)除了抗性。所以目前研究者們開(kāi)始關(guān)注昆蟲的基因組信息,轉(zhuǎn)錄組信息等,以期篩選害蟲應(yīng)答毒素蛋白的靶標(biāo)基因,從根本上對(duì)害蟲進(jìn)行防控。目前研究大猿葉甲基因進(jìn)展緩慢,而且至今尚未有人公布大猿葉甲全基因組信息。大猿葉甲的完整轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)在實(shí)驗(yàn)室的前期研究中已經(jīng)取得,得到了SSR標(biāo)簽相關(guān)信息及其與Sip毒素蛋白互作過(guò)程中的信息,發(fā)現(xiàn)與解毒代謝相關(guān)的基因發(fā)生了差異性表達(dá),其中常見(jiàn)的細(xì)胞色素P450,核糖體蛋白S8和L14以及肌肉蛋白LIM都發(fā)生了差異性表達(dá)。本研究分析了大猿葉甲在Sip毒素蛋白作用前后SSR標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增差異,發(fā)現(xiàn)被Sip毒素蛋白作用后,PCR擴(kuò)增條帶大小與Sip蛋白作用前并無(wú)差別,但是略呈彌散狀。選擇了P450,S8,L14和LIM這四個(gè)差異基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并構(gòu)建原核表達(dá)載體,分別表達(dá)高效約56 kDa,30 kDa,25 kDa和89 kDa的目的蛋白。分別擴(kuò)增P450,S8,L14和LIM四個(gè)差異基因的核心片段,提取測(cè)序正確的正向插入片段和反向插入片段質(zhì)粒,單酶切線性化后以此為模板合成雙鏈RNA,測(cè)定RNA濃度并稀釋至5.0μg/μL,注射至3齡/4齡末期大猿葉甲幼蟲體內(nèi)(約2μL),分別注射成功后1d,3d,5d和7d提取中腸進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,注射一天后,S8,L14和LIM表達(dá)量均無(wú)明顯變化,而P450的表達(dá)量則明顯降低;到了第三天,S8,L14和P450基因表達(dá)量已相當(dāng)微弱,表明干擾成功;而LIM基因到了第三天表達(dá)量?jī)H有少許減弱,第五天相比第一天也稍有減弱,但與第三天差距不明顯,直到第七天,基因表達(dá)量大幅度減弱,表明干擾成功。分別將未經(jīng)處理的大猿葉甲和RNA干擾后的大猿葉甲飼喂Sip蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在飼喂蛋白12小時(shí)后,各組均未見(jiàn)死亡,24小時(shí)后,S8死亡率與對(duì)照組幾乎無(wú)差別,P450死亡率相比于對(duì)照組略有下降,L14和LIM死亡率高于對(duì)照組;48小時(shí)后,L14死亡率略高于對(duì)照組,其他均有所下降,但差別不大;從第三天開(kāi)始,四個(gè)干擾組死亡率已明顯高于對(duì)照組,直到第七天全部死亡。此結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果大致相符。本研究結(jié)果對(duì)篩選大猿葉甲靶標(biāo)基因,進(jìn)一步防治大猿葉甲等鞘翅目昆蟲提供了良好的材料,也可以對(duì)進(jìn)一步篩選相應(yīng)的Bt毒素蛋白受體提供新的思路,更為Sip蛋白日后的改造和實(shí)際應(yīng)用提供初步的理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 1-1 蘇云金芽胞桿菌的芽胞和晶體[47]Figure 1-1 The spore and crystal in Bacillus thuringiensis[47]注：A-F：Bt 菌株的掃描電鏡圖；S：芽胞，C：晶體.4 Sip 蛋白Sip 毒素蛋白是 Bt 殺蟲家族中的分泌型殺蟲蛋白，對(duì)鞘翅目幼蟲表現(xiàn)出明顯毒性。在面研究上，Donovan 等人培養(yǎng)了他們隨機(jī)挑選的一些 Bt 菌株，在這些菌株的上清液中發(fā)其能夠殺死科羅拉多馬鈴薯甲蟲（CPB）幼蟲，這些研究人員選擇了其中一個(gè)菌株進(jìn)行研究，克隆出包含 1104 個(gè)堿基，編碼 367 個(gè)氨基酸的新型 Bt 毒素蛋白，并將其命名p1A[48]。將 Sip1A 進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與 Mtx3 之間的相似性為 46％，并且 Sip1A 還起煙草蚜蟲，棉鈴蟲幼蟲和玉米根葉甲蟲的萎縮和體重減輕[48, 49]。劉艷杰等人于 2012 年從 Bt 菌株 QZL26 中鑒定和克隆了 Sip 基因，但并未報(bào)道其殺蟲[50]。Murawska 等人于 2013 年使用基因組測(cè)序技術(shù)顯示 IS5056 質(zhì)粒 pIS56-328 含有 Siy 等基因，但是他們僅描述了 cry1Aa3，cry1Ah21 和 cry1Ba1 的特征及殺蟲活性，并未對(duì)因進(jìn)行描述[51]。張金波等人在 2015 年克隆了來(lái)自 DQ89 Bt 菌株的長(zhǎng)度為 1188bp 的 si并顯示其對(duì)大猿葉甲有著較高的殺蟲活性[52]。沙君雪于 2017 年在 Bt 菌株 QZL38 中鑒定隆出了長(zhǎng)度為 1095，編碼 365 個(gè)氨基酸的 sip 基因，其對(duì)大猿葉甲具有較高的殺蟲活性

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程碩士學(xué)位論文種的遺傳多樣性[59-60]。沙君雪等對(duì)大猿葉甲全蟲進(jìn)行測(cè)序，利從頭組裝獲得大猿葉甲完整轉(zhuǎn)錄譜。從多數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)比分析可以參考的大猿葉甲轉(zhuǎn)錄組和 SSR 分子標(biāo)記的數(shù)據(jù)[61,62]。大實(shí)驗(yàn)室的前期研究中已經(jīng)取得，用其構(gòu)建大猿葉甲基因組文庫(kù)00 對(duì)引物中篩選出了 22 對(duì)多態(tài)性 SSR 引物并進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增后的研究提供了部分參考。的篩選金芽胞桿菌 Sip 蛋白處理大猿葉甲后差異基因，分別將 pET21白和 1μg·mL-1Sip 蛋白作用于大猿葉甲幼蟲，分別提取 pET21b甲中腸，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。以閾值: |log2(FoldChange)| > 1 且 q對(duì)樣品的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行差異表達(dá)分析，共獲得 341 個(gè)差異表達(dá)2。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S476.11

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3 吳U，

本文編號(hào)：2595923