【摘要】：病原卵菌在侵染寄主的過程中,通過分泌大量的RxLR效應(yīng)因子干擾植物,導(dǎo)致植物疫病的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)RxLR145在辣椒疫霉侵染1.5h就開始大量表達(dá),具有能夠引起煙草葉片壞死,抑制毒性蛋白BAX引起的煙草葉片細(xì)胞壞死等功能。本研究首先解析了RxLR145的三維結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的8個(gè)RxLR效應(yīng)因子結(jié)構(gòu),全面總結(jié)了RxLR效應(yīng)因子的結(jié)構(gòu)特征。結(jié)構(gòu)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),RxLR145和DNA/RNA結(jié)合蛋白在三維結(jié)構(gòu)上具有很高的相似性。結(jié)合RxLR145表面分布大量正電荷,我們推測(cè)其可能通過特異性結(jié)合寄主體內(nèi)一些DNA/RNA行使作用。為了驗(yàn)證這一推論,本研究運(yùn)用CHIP-Seq技術(shù)篩選了RxLR145在擬南芥中的特異性DNA結(jié)合序列,并利用EMSA、MST以及SPR驗(yàn)證RxLR45確實(shí)可以和DNA序列進(jìn)行特異性結(jié)合。為了更深入了解RxLR145作用機(jī)制,本研究進(jìn)行了RxLR145的轉(zhuǎn)基因擬南芥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)RxLR145能夠調(diào)控?cái)M南芥中12849個(gè)基因的表達(dá)量。其中6322個(gè)基因表達(dá)下調(diào),6527個(gè)基因上調(diào)。這些基因涉及到蛋白泛素化、磷酸化,植物和病原物互作,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白加工,調(diào)節(jié)自噬,內(nèi)吞作用以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。而CHIP-Seq結(jié)果說明RxLR145結(jié)合的特異性DNA是位于這些通路中相關(guān)基因的上游的。二者結(jié)果相結(jié)合說明RxLR145通過行使轉(zhuǎn)錄因子的功能調(diào)控寄主的防衛(wèi)反應(yīng),具體結(jié)果如下:1、解析RxLR145效應(yīng)因子的結(jié)構(gòu):每個(gè)晶體非對(duì)稱單元含有兩分子的RxLR145,N端RxLR-dEER區(qū)域沒有電子云密度,是無序的。C端由5個(gè)WY區(qū)域組成,每個(gè)WY區(qū)域都由4個(gè)α螺旋和三個(gè)無規(guī)則卷曲組成。每個(gè)WY之間由一個(gè)短的α螺旋(linker螺旋)相互連接。2、通過比對(duì)所有已報(bào)道RxLR效應(yīng)因子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn):(1)WY區(qū)域構(gòu)象差別集中在K-motif和第三個(gè)無規(guī)則折疊區(qū),說明這兩個(gè)區(qū)域承擔(dān)了大部分的進(jìn)化壓力。(2)linker螺旋具有調(diào)節(jié)WY區(qū)域排列方式的作用,改變WY區(qū)域的排列方式可能是RxLR效應(yīng)因子另一種潛在進(jìn)化方式;(3)WY區(qū)域會(huì)發(fā)生motif缺失或改變;(4)所有的RxLR結(jié)構(gòu)表面都分布有大量正電荷,暗示該類效應(yīng)因子寄主內(nèi)靶標(biāo)可能是帶負(fù)電荷的。3、CHIP-Seq結(jié)果證明了RxLR145和MADS-box轉(zhuǎn)錄因子以及亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子的特異性識(shí)別序列結(jié)合,進(jìn)而可能調(diào)控蛋白泛素化及磷酸化等途徑。4、RxLR145能調(diào)控?cái)M南芥中12849個(gè)基因的表達(dá)量。其中6322個(gè)基因表達(dá)下調(diào),6527個(gè)基因上調(diào)。這些基因涉及到蛋白泛素化、磷酸化,植物和病原物互作,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白加工,調(diào)節(jié)自噬,內(nèi)吞作用以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。RxLR145的轉(zhuǎn)基因擬南芥RNA-Seq結(jié)果和CHIP-Seq結(jié)果顯示二者包含662種共有細(xì)胞通路。這些通路主要包括核糖體組成、轉(zhuǎn)錄、氨基酸代謝調(diào)控、植物泛素化以及蛋白磷酸化。這一結(jié)果表明RxLR145可能通過結(jié)合到能編碼泛素化及磷酸化蛋白的相關(guān)基因上,影響這些基因表達(dá),從而抑制植物免疫反應(yīng)的進(jìn)行。
【圖文】：

有報(bào)道稱 RxLR-dEER 基序是通過和寄主細(xì)胞膜上的 PI3P 結(jié)合而進(jìn)入寄主細(xì)胞的（Kale et al., 2010）。RxLR-dEER 保守域中，RxLR 己經(jīng)被證明是必需的，dEER 序列在信號(hào)傳導(dǎo)中也有一定的作用。竇道龍證明，RxLR 序列中 L 是必需的，同時(shí) R 被替換后病原侵染寄主數(shù)量大大減少（Dou et al., 2008）。但有研究質(zhì)疑這種說法。首先，來自真菌的 Avr M和 Avr L567進(jìn)入細(xì)胞并沒有 PI3P的參與。其次，AVR3a 和 PI3P結(jié)合位點(diǎn)是其 C 端帶正電荷的表面氨基酸（Yaeno et al., 2011）。目前對(duì)少數(shù)幾個(gè) RxLR效應(yīng)因子功能機(jī)制研究比較深入，比如 Avr3a 可通過穩(wěn)定泛素化連接酶 CMPG1 調(diào)控寄主防衛(wèi)反應(yīng)（Bos et al., 2006）。Avr2和磷酸激酶 BSL1互作，涉及油菜素類固醇信號(hào)途徑（Saunders et al., 2012）。AvrBlb2 能夠阻止防衛(wèi)蛋白酶的分泌（Bozkurt et al.,2006）。Pi03192 和 NAC 轉(zhuǎn)錄因子互作阻止自身定位發(fā)生變化（McLellan et al., 2013）。PexRD2 和 MAP3K 互作阻止抗病信號(hào)途徑（King et al., 2014）。Pi04314 和一種磷酸酶PP1c 互作，促進(jìn)致病疫霉的侵染（Boevink et al., 2016）。這些 RxLR 效應(yīng)因子互作模式如圖 1-2 所示。

圖 1-2卵菌一些 RxLR效應(yīng)因子作用模式Fig. 1-2 Binding partner of some RxLR effectors析，使我們更直觀的了解此類蛋白。2008 年菌的效應(yīng)因子和 R 蛋白 AvrPto-Pto 的復(fù)合物機(jī)制，，為這類作用機(jī)制研究提供思路（Xiang庫(kù)中收錄了 8 個(gè) RxLR 效應(yīng)因子的結(jié)構(gòu)，分別由 7 個(gè) WY 區(qū)域組成，是目前報(bào)道的分子量最 ATR1，該蛋白除了 2 個(gè) WY 區(qū)域，還含有Chou et al., 2011）；上述兩個(gè)蛋白的每個(gè) Wα 螺旋被稱為“l(fā)inker”螺旋。從致病疫霉中分離白的 WY 區(qū)域之間并沒有“l(fā)inker”螺旋的存在，的 AIM 區(qū)域存在一個(gè)“l(fā)inker”螺旋（Maqbool 和 PexRD2 以及分離自辣椒疫霉的 AVR3a11
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S432.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2594920