【摘要】：十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是引起甘藍、西蘭花、花椰菜和蘿卜等重要的十字花科作物黑腐病的病原細菌,也是研究植物與病原菌互作分子機理的模式菌。本研究組之前的研究發(fā)現(xiàn),在十字花科黑腐病菌8004菌株(簡稱Xcc8004)中,一個與細菌RNA分子伴侶蛋白Hfq高度相似的蛋白HfqXcc可能在該菌的致病和細胞運動等過程中起重要作用。本工作的目的是明確HfqXcc的生物學功能和生化功能并對其發(fā)揮功能的機理進行深入研究。對hfqXcc缺失突變體及其互補菌株的表型分析結(jié)果顯示,hfqXc缺失導致Xcc致病力顯著下降、致病因子合成明顯減少、細胞運動能力減弱以及對高滲透壓的耐受能力下降,而且這些變化的表型能夠被hfq反式互補,證明HfqXcc在Xcc的致病、致病因子產(chǎn)生、細胞運動以及對脅迫的響應等生理過程中起關(guān)鍵作用。我們發(fā)現(xiàn),盡管hfqXcc缺失不影響小RNAsRXcc-141的轉(zhuǎn)錄,卻能導致sRXcc-141在細胞內(nèi)的積累量嚴重下降,說明HfqXcc具有穩(wěn)定sRXcc-141的功能。Co-IP實驗結(jié)果顯示,HfqXcc在體內(nèi)能夠與sRXcc-141特異結(jié)合。這些結(jié)果證明HfqXcc具有RNA分子伴侶的功能。Hfq是一個由大約100個氨基酸殘基組成的小蛋白。生物信息學分析結(jié)果顯示,在不同的細菌中,Hfq的N端1～66位氨基酸序列高度保守,而66位以后的氨基酸(C端)則是高度可變的。之前有研究表明,Hfq的C端缺失不影響其生物學功能。相反,我們的結(jié)果顯示,HfqXcc C端對HfqXcc的功能是必須的。為了弄清hfpXcc缺失導致Xcc表型變化的原因,我們采用轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析來鑒定hfqXcc缺失導致的基因表達變化,并進一步確定HfqXcc的調(diào)控元。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示,在豐富培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,有51個基因的表達受HfqXcc調(diào)控(其中23個基因受HfqXcc正調(diào)控,28個基因受HfqXc負調(diào)控)。這51個受HfqXcc調(diào)控基因涵蓋了致病和適應性、細胞被膜和細胞結(jié)構(gòu)、能量和碳代謝、信號傳導、翻譯、運輸?shù)裙δ茴愋�。蛋白組分析結(jié)果顯示,在豐富培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,有157個蛋白的表達受HfqXcc調(diào)控(其中122個蛋白受HfqXcc正調(diào)控,35個蛋白受HfqXcc負調(diào)控)。這157個受HfqXcc調(diào)控的蛋白涵蓋了 18種功能類型(包括中間代謝、能量和碳代謝、致病和適應性、翻譯、轉(zhuǎn)運,以及少數(shù)的與細胞被膜和細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)、細胞過程、輔酶因子和載體合成、脂肪酸和磷脂代謝、調(diào)控和轉(zhuǎn)錄等)。這些結(jié)果說明,在Xcc中,HfqXcc是一個全局調(diào)控因子。但遺憾的是,轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析未能理清HfqXcc影響相關(guān)表型的直接通路。由于hfqXcc缺失導致Xcc胞外多糖(EPS)產(chǎn)量顯著下降,而gum基因簇是Xcc合成EPS必須的,我們采用Northern雜交方法檢測了野生型菌株和hfq缺失突變體中g(shù)um mRNA的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),hfqXcc缺失導致gum mRNA的水平顯著下降,證明HfqXcc正調(diào)控gum基因簇的表達。由于HfqXcc既不能與gum基因簇啟動子直接結(jié)合,也不能與gum基因簇5'-UTRmRNA直接結(jié)合,因此,HfqXcc對gum基因簇的調(diào)控可能是間接的。綜上所述,本工作對HfqXcc在Xcc中的生物學功能、生化功能及其發(fā)揮功能的機理進行了研究,明確了 HfqXcc的RNA分子伴侶功能及其在Xcc中的重要作用,這些結(jié)果拓寬了人們對Xcc的致病調(diào)控網(wǎng)絡的認識。
【圖文】：

起始位點Ｔ；紫色加粗字母ＡＴＧ為起始密碼子。逡逑（１）帶六組氨酸標簽Ｈｆｑｘｒｃ蛋白的表達與純化逡逑常規(guī)ＰＣＲ擴增／？／r潰炕潁翁∥玻罰瑰澹猓皰澹ㄍ跡常擔粒壕炕⒚蓋�、辶x狹�、转化、ＰＣＲ和矎T蜓櫓せ竦貌咦櫓柿＃校牛裕常埃齲媯皴澹ㄍ跡常擔攏喚椋椋歟日峰義系鬧刈櫓柿＃校牛裕常埃齲媯褡簾澩鎪蓿簦攏蹋玻輩赍竦帽澩錚停赍義希攏蹋玻保校牛裕常埃齲媯�，用又O亂徊絞笛椋ň嚀騫菇ǚ椒玻保常保ｅ義習床牧嫌敕椒ǎ玻保炒炕齲媯�；＾蛋白，通过涯循ＰＡ颗凝胶道i窘屑觳獯垮義匣模齲媯瘢岬鞍，

本文編號：2593260