【摘要】：十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是引起甘藍(lán)、西蘭花、花椰菜和蘿卜等重要的十字花科作物黑腐病的病原細(xì)菌,也是研究植物與病原菌互作分子機(jī)理的模式菌。本研究組之前的研究發(fā)現(xiàn),在十字花科黑腐病菌8004菌株(簡(jiǎn)稱(chēng)Xcc8004)中,一個(gè)與細(xì)菌RNA分子伴侶蛋白Hfq高度相似的蛋白HfqXcc可能在該菌的致病和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等過(guò)程中起重要作用。本工作的目的是明確HfqXcc的生物學(xué)功能和生化功能并對(duì)其發(fā)揮功能的機(jī)理進(jìn)行深入研究。對(duì)hfqXcc缺失突變體及其互補(bǔ)菌株的表型分析結(jié)果顯示,hfqXc缺失導(dǎo)致Xcc致病力顯著下降、致病因子合成明顯減少、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減弱以及對(duì)高滲透壓的耐受能力下降,而且這些變化的表型能夠被hfq反式互補(bǔ),證明HfqXcc在Xcc的致病、致病因子產(chǎn)生、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及對(duì)脅迫的響應(yīng)等生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。我們發(fā)現(xiàn),盡管hfqXcc缺失不影響小RNAsRXcc-141的轉(zhuǎn)錄,卻能導(dǎo)致sRXcc-141在細(xì)胞內(nèi)的積累量嚴(yán)重下降,說(shuō)明HfqXcc具有穩(wěn)定sRXcc-141的功能。Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HfqXcc在體內(nèi)能夠與sRXcc-141特異結(jié)合。這些結(jié)果證明HfqXcc具有RNA分子伴侶的功能。Hfq是一個(gè)由大約100個(gè)氨基酸殘基組成的小蛋白。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,在不同的細(xì)菌中,Hfq的N端1～66位氨基酸序列高度保守,而66位以后的氨基酸(C端)則是高度可變的。之前有研究表明,Hfq的C端缺失不影響其生物學(xué)功能。相反,我們的結(jié)果顯示,HfqXcc C端對(duì)HfqXcc的功能是必須的。為了弄清hfpXcc缺失導(dǎo)致Xcc表型變化的原因,我們采用轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析來(lái)鑒定hfqXcc缺失導(dǎo)致的基因表達(dá)變化,并進(jìn)一步確定HfqXcc的調(diào)控元。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示,在豐富培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,有51個(gè)基因的表達(dá)受HfqXcc調(diào)控(其中23個(gè)基因受HfqXcc正調(diào)控,28個(gè)基因受HfqXc負(fù)調(diào)控)。這51個(gè)受HfqXcc調(diào)控基因涵蓋了致病和適應(yīng)性、細(xì)胞被膜和細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量和碳代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯、運(yùn)輸?shù)裙δ茴?lèi)型。蛋白組分析結(jié)果顯示,在豐富培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,有157個(gè)蛋白的表達(dá)受HfqXcc調(diào)控(其中122個(gè)蛋白受HfqXcc正調(diào)控,35個(gè)蛋白受HfqXcc負(fù)調(diào)控)。這157個(gè)受HfqXcc調(diào)控的蛋白涵蓋了 18種功能類(lèi)型(包括中間代謝、能量和碳代謝、致病和適應(yīng)性、翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn),以及少數(shù)的與細(xì)胞被膜和細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)、細(xì)胞過(guò)程、輔酶因子和載體合成、脂肪酸和磷脂代謝、調(diào)控和轉(zhuǎn)錄等)。這些結(jié)果說(shuō)明,在Xcc中,HfqXcc是一個(gè)全局調(diào)控因子。但遺憾的是,轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析未能理清HfqXcc影響相關(guān)表型的直接通路。由于hfqXcc缺失導(dǎo)致Xcc胞外多糖(EPS)產(chǎn)量顯著下降,而gum基因簇是Xcc合成EPS必須的,我們采用Northern雜交方法檢測(cè)了野生型菌株和hfq缺失突變體中g(shù)um mRNA的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),hfqXcc缺失導(dǎo)致gum mRNA的水平顯著下降,證明HfqXcc正調(diào)控gum基因簇的表達(dá)。由于HfqXcc既不能與gum基因簇啟動(dòng)子直接結(jié)合,也不能與gum基因簇5'-UTRmRNA直接結(jié)合,因此,HfqXcc對(duì)gum基因簇的調(diào)控可能是間接的。綜上所述,本工作對(duì)HfqXcc在Xcc中的生物學(xué)功能、生化功能及其發(fā)揮功能的機(jī)理進(jìn)行了研究,明確了 HfqXcc的RNA分子伴侶功能及其在Xcc中的重要作用,這些結(jié)果拓寬了人們對(duì)Xcc的致病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。
【圖文】：

起始位點(diǎn)Ｔ；紫色加粗字母ＡＴＧ為起始密碼子。逡逑（１）帶六組氨酸標(biāo)簽Ｈｆｑｘｒｃ蛋白的表達(dá)與純化逡逑常規(guī)ＰＣＲ擴(kuò)增／？／r潰炕潁翁∥玻罰瑰澹猓皰澹ㄍ跡常擔(dān)粒壕炕�、蒙w小㈠義狹�、转化、ＰＣＲ和矎T蜓櫓せ竦貌咦櫓柿＃校牛裕常埃齲媯皴澹ㄍ跡常擔(dān)攏喚椋椋歟日峰義系鬧刈櫓柿＃校牛裕常埃齲媯褡簾澩鎪蓿簦攏蹋玻輩赍�，获得睗湾P停赍義希攏蹋玻保校牛裕常埃齲媯瘢糜諳亂徊絞笛椋ň嚀騫菇ǚ椒玻保常保�。辶x習(xí)床牧嫌敕椒ǎ玻保炒炕齲媯瘢唬薜鞍祝ü櫻模櫻校粒牽拍旱纈窘屑觳獯垮義匣模齲媯瘢岬鞍，

本文編號(hào)：2593260