二化螟Peroxidasin基因表達(dá)模式與功能研究
發(fā)布時間:2020-02-16 15:27
【摘要】:Peroxidasins屬于過氧化物酶環(huán)氧合酶家族成員,過氧化物酶環(huán)氧合酶家族出現(xiàn)在所有的生物體中,和chordata peroxidases(脊索動物過氧化物酶)及peroxinectins有密切的聯(lián)系。Peroxidasins在生物體內(nèi)是一個高度保守但具體功能未知的基因。Peroxidasins是多結(jié)構(gòu)域基因,其全長包含一個信號肽、多個C型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(Ig)、多個富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRR)、一個血紅素過氧化物酶結(jié)構(gòu)域(POX)及一個血管性血友病因子C模塊結(jié)構(gòu)域(VWC)。研究表明,Peroxidasins與昆蟲血細(xì)胞和漿細(xì)胞的功能是有關(guān)聯(lián)的,參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、基底膜(BM)的生物合成,組織的發(fā)育和先天免疫防御等生命進(jìn)程,并催化H2O2介導(dǎo)的酪氨酸和碘的氧化。目前,二化螟Peroxidasin的體內(nèi)功能還不是很清楚,必須更全面地了解二化螟Peroxidasin基因的結(jié)構(gòu)及功能特點,才能更深入的了解其在二化螟體內(nèi)的作用方式及為其應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。因此,研究Perxidasin基因?qū)ΧL發(fā)育的影響及二化螟害蟲治理新措施的開發(fā)都具有重大意義。本文克隆了二化螟Perxidasin基因的全長cDNA序列,采用熒光實時定量PCR對該基因的不同生長發(fā)育階段與不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了分析,采用RNA干擾方法研究Peroxidasin基因被干擾后對高齡幼蟲和預(yù)蛹的影響,Peroxidasin的真核表達(dá)與活性等研究,試圖為Peroxidasin基因在二化螟體內(nèi)的功能做出解釋。1、二化螟Peroxidasin的結(jié)構(gòu)特征通過克隆得到了該基因的全長,通過對該序列分析,發(fā)現(xiàn)二化螟Peroxidasin與家蠶Peroxidasin序列有高度的同源性。Peroxidasin包含為胞外分泌的信號肽、富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRR)、C型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(Ig)以及血紅素過氧化物酶結(jié)構(gòu)域(POX)。通過結(jié)構(gòu)域比較發(fā)現(xiàn),在智人和果蠅Peroxidasin基因中含有血管性血友病因子C模塊結(jié)構(gòu)域(VWC),而在二化螟和家蠶Peroxidasin基因中,該結(jié)構(gòu)域是缺失的。2、二化螟Peroxidasin基因的時空表達(dá)分析實驗發(fā)現(xiàn),Peroxidasin在二化螟各個發(fā)育期都有表達(dá),從最高表達(dá)量的卵期開始隨著發(fā)育齡期表達(dá)量總體趨勢是下降的,到5齡達(dá)到幼蟲期的最低水平表達(dá)量,之后6齡、蛹期的表達(dá)水平隨之上升,并且雌蛹表達(dá)量高于雄蛹,羽化后的雌雄成蟲的表達(dá)水平為產(chǎn)卵后高于產(chǎn)卵前;在4齡、5齡、6齡這三個幼蟲齡期中,Peroxidasin的表達(dá)趨勢為先從初期的較高水平下降到中期的較低水平,然后上升到末期的較高水平,這三個齡期的趨勢大致相同。在6齡末期到預(yù)蛹階段表達(dá)水平總體最高,化蛹后逐漸降低,直到成蟲都是較低水平的表達(dá)。4齡幼蟲分別在第16小時和第112小時左右有兩個表達(dá)高峰,5齡幼蟲在第48小時和第128小時左右有兩個表達(dá)高峰,6齡幼蟲在第72小時達(dá)到最高表達(dá)水平。6齡二化螟Peroxidasin基因在頭部、表皮、馬氏管、血淋吧、中腸都有較高的表達(dá)水平,尤其是頭部最高,而脂肪體中的表達(dá)量均低于其他組織為最低表達(dá)量。3、二化螟Peroxidasin基因RNA干擾實驗經(jīng)過dsRNA處理的預(yù)蛹很明顯地難以完成預(yù)蛹-蛹的變態(tài)過程。其主要出現(xiàn)三種表型變化,(1)預(yù)蛹在完成化蛹后,中部至尾部脫皮不干凈,還有皮未脫離蛹體,并且觀察這些蛹可以發(fā)現(xiàn),其腹部發(fā)育畸形,蛹的整體形態(tài)不正常,后期觀察這些畸形蛹成活率低,在蛹期死亡,無法羽化為成蟲。(2)預(yù)蛹在化蛹過程中無法完成化蛹的變態(tài)過程,但是可以啟動化蛹過程,預(yù)蛹身體出現(xiàn)紅棕色的表皮,大部分身體區(qū)域出現(xiàn)蛹質(zhì)化表皮,但其腹部不能蛹質(zhì)化,保留原來預(yù)蛹階段的舊表皮,并且其胸足還存在,體形更類似于預(yù)蛹階段而非正常蛹的階段,這種畸形預(yù)蛹最終也無法完成化蛹,而導(dǎo)致死亡。(3)預(yù)蛹完全不能化蛹,保持預(yù)蛹形態(tài),蟲體畸形,有尾部變黑,頭部凸畸形現(xiàn)象出現(xiàn),蟲體有黑點,該畸形預(yù)蛹活力降低,最終保持該形態(tài)并死亡。實驗中注射了 GFP的對照預(yù)蛹可以完成正常的化蛹程序,且蛹光滑完好,與正常蛹無異。這說明Peroxidasin在二化螟預(yù)蛹到蛹的變態(tài)過程中起到很重要的作用。4、Peroxidasin的真核表達(dá)與活性通過利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在Sf9細(xì)胞系中成功地表達(dá)出二化螟Peroxidasin蛋白,并測定了其過氧化氫酶活性,其結(jié)果是顯著高于對照組,這說明該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的二化螟Peroxidasin蛋白是有活性的,具有過氧化物酶氧化過氧化氫的活性。這很可能與Peroxidasins含有動物過氧化物酶催化結(jié)構(gòu)域(POX)相關(guān)的。綜上所述,本實驗通過對二化螟Peroxidasin基因的克隆、時空表達(dá)分析、RNA干擾后對幼蟲的影響、二化螟Peroxidasin蛋白的獲得及活性測定。說明二化螟Peroxidasin基因包含為胞外分泌的信號肽、Qê漣彼嶂馗唇峁褂,
本文編號:2580144
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