【摘要】：桑園中殘留的大量農(nóng)藥,有通過桑樹富集最終對家蠶造成不良影響的潛在風險。采用富集培養(yǎng)和平板劃線分離的方法,從長期被農(nóng)藥污染的桑園土壤中篩選分離到一株可降解對家蠶有極高風險性的殺蟲劑啶蟲脒的細菌菌株H2。對分離菌株H2進行形態(tài)和生理生化特征及16S r DNA序列分析,鑒定其為產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)。該菌株對啶蟲脒的最高耐受濃度為1 200 mg/L;菌株在含300 mg/L啶蟲脒的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng),0~1 d為生長延遲期,1~4 d為對數(shù)生長期,4~6 d為穩(wěn)定期,6 d后進入衰亡期;菌株在啶蟲脒初始質(zhì)量濃度為300 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)9 d,對啶蟲脒的降解率為62.7%。同時發(fā)現(xiàn)H2菌株在分別含1 000 mg/L吡蟲啉、1 000 mg/L烯啶蟲胺、1 000 mg/L噻蟲啉和500 mg/L辛硫磷的無機鹽培養(yǎng)基中也能夠生長,說明H2菌株能有效降解多種煙堿類農(nóng)藥和有機磷類農(nóng)藥,有望進一步開發(fā)為桑園殘留煙堿類及有機磷類農(nóng)藥的微生物降解制劑。
【圖文】：

450蠶業(yè)科學2017;43(3)圖1菌株H2的菌落(A)與菌體(B)形態(tài)Fig.1Theclonies(A)andindividual(B)morphologicalcharacteristicsofbacterialstrainH2表2菌株H2的生理生化性狀Table2Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofbacte-rialstrainH2項目Item結果Ｒesult氧化酶試驗Oxidaseactivity+明膠液化試驗Gelatinliquefactiontest－接觸酶試驗Catalaseactivity+淀粉水解試驗Hydrolysisofstarch－麥芽糖發(fā)酵試驗Maltosefermentationtest－葡萄糖發(fā)酵試驗Glucosefermentationtest－硝酸鹽還原試驗Nitratereductiontest+甲基紅試驗Methylredtest－V-P測定試驗V-Ptest－檸檬酸鹽利用試驗Citratetest+“+”表示可利用或為陽性反應，“－”表示不可利用或為陰性反應�！�+”meansusableorpositivereaction，“－”meansnotusableornega-tivereaction.2.3菌株H2基于16SrDNA序列的分類鑒定啶蟲脒高效降解菌株H2的16SrDNAPCＲ擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。測序鑒定PCＲ產(chǎn)物序列長度為1440bp。將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進行BLAST比對，并選取與其同源性高的典型菌株16SrDNA序列，通過MEGA5.0軟件構建菌株的系統(tǒng)進化樹，結果見圖3。從進化樹可以看出，菌株H2與產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)菌株Y34的遺傳距離最近，聚在進化樹的同一個分支上，序列相似度為99%。結合菌株H2的形態(tài)觀察與生理生化性狀測試結果，將其鑒定為產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonasal-caligenes)，命名為PseudomonasalcaligenesH2菌株。2.4菌株H2的生長曲線將菌株H2接種于含300mg/L啶蟲脒的無機鹽液體培養(yǎng)基，測定其生長曲線，結果如圖4所示。該菌株接種在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)0～1d為生長延遲期，表明菌株對啶蟲脒的適應時間較長;?

alaseactivity+淀粉水解試驗Hydrolysisofstarch－麥芽糖發(fā)酵試驗Maltosefermentationtest－葡萄糖發(fā)酵試驗Glucosefermentationtest－硝酸鹽還原試驗Nitratereductiontest+甲基紅試驗Methylredtest－V-P測定試驗V-Ptest－檸檬酸鹽利用試驗Citratetest+“+”表示可利用或為陽性反應，“－”表示不可利用或為陰性反應�！�+”meansusableorpositivereaction，“－”meansnotusableornega-tivereaction.2.3菌株H2基于16SrDNA序列的分類鑒定啶蟲脒高效降解菌株H2的16SrDNAPCＲ擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。測序鑒定PCＲ產(chǎn)物序列長度為1440bp。將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進行BLAST比對，并選取與其同源性高的典型菌株16SrDNA序列，通過MEGA5.0軟件構建菌株的系統(tǒng)進化樹，結果見圖3。從進化樹可以看出，菌株H2與產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)菌株Y34的遺傳距離最近，聚在進化樹的同一個分支上，序列相似度為99%。結合菌株H2的形態(tài)觀察與生理生化性狀測試結果，將其鑒定為產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonasal-caligenes)，命名為PseudomonasalcaligenesH2菌株。2.4菌株H2的生長曲線將菌株H2接種于含300mg/L啶蟲脒的無機鹽液體培養(yǎng)基，測定其生長曲線，結果如圖4所示。該菌株接種在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)0～1d為生長延遲期，表明菌株對啶蟲脒的適應時間較長;接種培養(yǎng)1～4d為生長對數(shù)期，此時菌株快速生長;接種培養(yǎng)4～6d為穩(wěn)定期，培養(yǎng)基D(600nm)值無明顯變化;接種培養(yǎng)6d后，D(600nm)值開始下降，菌株H2進入衰亡期。2.5菌株H2對啶蟲脒的降解能力配制質(zhì)量濃度為300mg/L的啶蟲脒標準樣品，經(jīng)高效液相色譜檢測得到其保留時間為22.198min的單一峰，且峰型較好，基本無雜峰(圖略)。同樣條件下檢測接入菌株H2后培養(yǎng)不?

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