【摘要】：【目的】克隆得到棉蚜(Aphis gossypii)P450 CYP6CY3,將其開放閱讀框(ORF)在原核細胞中進行表達,純化融合蛋白,多次免疫小鼠獲得CYP6CY3多克隆抗體,為進一步分析CYP6CY3在棉蚜不同組織部位的分布及其在抗性中的作用打下基礎。【方法】利用RT-PCR及3′-RACE技術(shù)克隆獲得CYP6CY3的ORF,并對其進行生物信息學及系統(tǒng)進化分析。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-CYP6CY3,轉(zhuǎn)化大腸桿菌transetta(DE3)進行原核表達,利用切膠回收法獲得純化的融合蛋白,繼而用純化得到的融合蛋白免疫昆明白小鼠制備鼠抗棉蚜CYP6CY3多克隆抗體;ELISA檢測鼠抗CYP6CY3蛋白多克隆抗體的效價,并通過Western blot及免疫組化檢測該抗體特異性�！窘Y(jié)果】棉蚜CYP6CY3 ORF長1 266 bp,編碼421個氨基酸,預測蛋白分子量為48.8 k D,理論等電點為8.99,不含有信號肽序列,屬親水性蛋白;氨基酸序列包括W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G 5個P450家族的特征基序。通過NCBI Blastx進行同源序列的比對分析,棉蚜CYP6CY3氨基酸序列與豌豆長管蚜(Acyrthosiphon pisum)(XP_001948581.1)氨基酸一致性最高,達到81%,與麥雙尾蚜(Diuraphis noxia)(XP_015379193.1)一致性為79%,與桃蚜(myzus persicae)(AHB52749.1)氨基酸序列一致性為76%,4種蚜蟲的氨基酸序列都含有位于螺旋K中參與穩(wěn)定核心結(jié)構(gòu)的E××R完全保守序列及P450基因標志性的F××G×××C×G(358—367)血紅素結(jié)合位點的共有序列。使用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,顯示棉蚜、豌豆長管蚜、麥雙尾蚜及桃蚜聚為一類,親緣關系較近。通過原核表達得到的CYP6CY3融合蛋白的相對分子量約為66 k D,基于純化的CYP6CY3重組蛋白多次免疫昆明白小鼠制備多克隆抗體,ELISA檢測獲得的鼠抗CYP6CY3抗體效價達到1㑳409 600。Western blot和免疫組化進一步證實,該抗體既能與異源表達的CYP6CY3蛋白特異性結(jié)合,也能與棉蚜組織中存在的天然CYP6CY3蛋白特異性結(jié)合,具有較好的免疫反應特異性�！窘Y(jié)論】利用3′-RACE技術(shù)克隆獲得CYP6CY3的開放閱讀框,并用異源表達的蛋白免疫昆明白小鼠制備了高滴度、特異性強的鼠抗棉蚜CYP6CY3的多克隆抗體,可用于進一步研究CYP6CY3功能及其在棉蚜抗藥性方面的作用。
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7期魏原杰等：棉蚜P450CYP6CY3的克壟原核表達及多克隆抗體的制備1355200010007505002501002000100075050025010020001000750500250100bpbpbpM1M--2M3--ABCA：CYP6CY3部分序列PCR產(chǎn)物PartialsequencePCRproductofCYP6CY3；M：DNAMarker；1：PCR產(chǎn)物PCRproduct。B：3′-RACE產(chǎn)物3′-RACEproduct；2：第1輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為第2輪的模板擴增得到的PCR產(chǎn)物PCRproductwas100timesdilutedandthentakenasthetemplateofthelaterPCR。C：ORF擴增AmplificationoftheORF；3：PCR產(chǎn)物PCRproduct；--：陰性對照Negativecontrol圖1棉蚜CYP6CY3擴增Fig.1AmplificationofCYP6CY3fromA.gossypii1176261515122676301101376126451151526176601201676226751251826276901301976326105135111263761201401方框內(nèi)為起始和終止密碼子Insidetheboxforthestartandstopcodons；CYP6CY3蛋白保守結(jié)構(gòu)域：W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G用下劃線標出CYP6CY3conservedmotifsincludingW×××R,AG××T,E××R,P××F×PE/DRTandF××G×××C×Gwereunderlinedinbold圖2棉蚜CYP6CY3的開放閱讀框核苷酸序列及推導的氨基酸序列Fig.2ORFsequenceandthededucedaminoacidsequenceofCYP6CY3fromA.gossypii無信號肽序列（圖3-A），ProtScale分析平均疏水性指數(shù)為-0.192，屬親水性蛋白（圖3-B）。通過NCBIBlastx進行同源序列的比對分析，結(jié)果顯示，棉蚜CYP6CY3氨基酸序列與豌豆長管蚜

鶚敲舾釁廢檔?4、59倍[20]，這與石緒根[11]的研究結(jié)果一致，進一步說明了該基因在禾谷縊管蚜及棉蚜對吡蟲啉產(chǎn)生抗性中具有重要作用。1701301007055403525M1BabkDA100μm100μmA：多克隆抗體與融合蛋白His-CYP6CY3Westernblot鑒定PolyclonalantibodycombinedwithHis-CYP6CY3fusionproteinspecificityofdetectionWesternblot；M：蛋白MarkerProteinMarker；1：融合蛋白Fusionprotein。B：免疫組化Immunohistochemistry；a：免疫前血清Pre-immuneserum；b：免疫后血清Afterimmunizationserum圖8多克隆抗體與CYP6CY3特異性結(jié)合的檢測Fig.8DetectionofpolyclonalantibodyspecificitybindingtoCYP6CY3隨著分子生物學和DNA重組技術(shù)的發(fā)展，對于P450的異源表達系統(tǒng)常用的有大腸桿菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)以及哺乳動物細胞表達系統(tǒng)[21]。大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最常用的異源蛋白表達系統(tǒng)，具有表達水平高，技術(shù)要求低等優(yōu)點，但其不能夠進行翻譯后修飾表達出的大部分真核蛋白不具有生物活性[21]。目前已有的報道使用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的昆蟲細胞色素P450酶基因有棉鈴蟲CYP6B7[22]和CYP6B6[23]以及微小按蚊CYP6AA3[24]，，褐飛虱CYP4C62[25]等基因。筆者研究組前期已經(jīng)成功在原核表達系統(tǒng)中表達了棉鈴蟲的CYP6B6蛋白，并制備得到了特異性好效價高的多克隆抗體[12,23]。所以在本研究中通過3′-RACE克隆得到了CYP6CY3ORF，然后利用原核表達系統(tǒng)誘導并純化了CYP6CY3融合蛋白。His-CYP6CY3為包涵體蛋白，不具備生物活性，而制備多克隆抗體不需要得到其具有生物活性的蛋白，并且包涵體表達量大，可以純化得到大量目的蛋白[12]。采用切膠回收的方法純化包涵體蛋
【作者單位】： 新疆大學生命科學與技術(shù)學院/生物資源與基因工程重點實驗室;新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所;
【基金】：國家自然科學基金-新疆聯(lián)合基金(U1603331) 新疆自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程(qn2015yx001)
【分類號】：S433.39


本文編號：2539588