【摘要】：我國水稻秸稈資源豐富,但由于其難降解的特征,限制了其開發(fā)利用。利用微生物資源實現(xiàn)對水稻秸稈資源的降解研究,已日趨成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點。Pantoea ananatis Sd-1是本實驗室分離得到的一株具有高效降解水稻秸稈能力的水稻內(nèi)生細菌,為了進一步探索Sd-1降解水稻秸稈的條件及其對木質(zhì)纖維素材料的降解機理,本文主要開展了以下三部分的研究。(1)最佳條件探索與成分分析利用水稻秸稈為唯一碳源,通過單因素實驗與三因素三水平的正交優(yōu)化實驗得到了Sd-1降解水稻秸稈的最佳組合條件為接種量1.5%、pH10、秸稈含量2.5%,在該條件下,Sd-1對秸稈的降解率為46%。以預(yù)處理水稻秸稈為唯一碳源,連續(xù)6天研究了Sd-1對預(yù)處理水稻秸稈的降解率,在第3天達到最大值61.8%。通過GC-MS分析預(yù)處理秸稈降解后發(fā)酵液的成分,鑒定出了一些構(gòu)成木質(zhì)素的低分子苯化合物(如苯酚、苯乙酸等)以及一些酸類物質(zhì)。(2)酶活變化與降解能力的研究定性培養(yǎng)基檢測,確定了Sd-1具有分泌過氧化物酶、漆酶、纖維素酶和半纖維素酶的能力。以預(yù)處理秸稈為唯一碳源,連續(xù)6天檢測了上述四種木質(zhì)纖維素降解酶在秸稈降解過程中的活性變化,發(fā)現(xiàn)Sd-1產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶和纖維素酶的活性均在第3天達到最大值,分別為5.9 U/mL、600 U/L和295 U/mL,而產(chǎn)生的半纖維素酶在第一天即達到最大值1345 U/mL。通過對預(yù)處理秸稈中的木質(zhì)纖維素組分含量的測定,發(fā)現(xiàn)Sd-1對秸稈中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解率在第六天分別達到了35.62%、78.8%和75.2%。(3)漆酶的克隆與純化通過對Sd-1全基因組的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)四段CDS序列(lac1-lac4)可能編碼漆酶。進一步的進化樹分析、同源序列分析與三維結(jié)構(gòu)分析,確定Lac4為典型的細菌漆酶。對Lac4進行克隆與原核表達,SDS-PAGE顯示其分子量約為60 kDa,Lac4酶活在以ABTS為底物時的最佳pH為2.5,在愈創(chuàng)木酚為底物時的pH為4.5。Lac4具有極度耐酸性,金屬離子穩(wěn)定性且受到Fe2+與Cu2+顯著促進。Lac4具有氧化非酚型(ABTS)和酚型(愈創(chuàng)木酚)化合物的能力,對ABTS的親和性Km值達到1.03±0.154 mM。Lac4具有使染料脫色能力,尤其是能快速有效使剛果紅脫色,在有介質(zhì)ABTS的存在下,其脫色率可達89%;Lac4在體外試驗中能使木質(zhì)素的降解率達到38%,通過GC-MS分析Lac4降解木質(zhì)素后的產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)了一些小分子的苯環(huán)化合物如苯酚、鄰苯二甲醛、苯二酚、苯乙酸等,進一步說明Lac4具有降解木質(zhì)素成小分子物質(zhì)的能力。另外通過定量PCR檢測Lac4在預(yù)處理水稻秸稈培養(yǎng)基中的表達水平,其結(jié)果說明Lac4的表達受到木質(zhì)纖維素的誘導(dǎo)。
【圖文】：

內(nèi)生細菌 Pantoea ananatis Sd-1 降解水稻秸稈性能與漆酶催化性質(zhì)的研究賴 Fe3+和 Fe4+，通過多步的電子傳遞和形成一些中間自由基（如苯氧基和二甲氧基芐醇基離子）氧化底物，這些中間自由基能夠承受非酶促氧化反應(yīng)，如自由基的偶聯(lián)聚合作用、側(cè)鏈的切除、脫甲基作用和內(nèi)部分子的疊加與重排[21]。木質(zhì)素過氧化物酶不同于其他的過氧化物酶（如錳過氧化物酶），木質(zhì)素過氧化物酶具有氧化非酚型芳香化合物的能力，在氧化的過程中不需要介質(zhì)的參加，因為木質(zhì)素過氧化物酶本身就具有很高氧化還原電勢, LiP 的氧化還原電勢可以達到 1.4 V[21-22]。木質(zhì)素過氧化物酶的晶體結(jié)構(gòu)顯示其催化氧化活性中心血紅素基團被埋在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，必須通過一個通道才能進入外部的媒介發(fā)揮作用，盡管通道的大小不足以讓大分子聚合物木質(zhì)素與埋在木質(zhì)素過氧化物酶內(nèi)部的血紅素基團連接，但是一些小的分子基團可以找到適合的分子結(jié)合位點[23]。木質(zhì)素過氧化物酶催化作用過程中的電子循環(huán)圖如圖 1.2 所示[24-25]。

圖 1.3 MnP 依賴過氧化氫和金屬離子氧化催化過程中的電子傳遞循環(huán)示意圖[24]1.3.5 多樣過氧化物酶 (Versatile peroxidases)多樣過氧化物酶 (EC 1.11.1.16) 也是一種含有血紅素的木質(zhì)素降解過氧化物酶，具有結(jié)合木質(zhì)過氧化物酶和錳過氧化物酶的混合型分子結(jié)構(gòu)。多樣過氧化物酶分子量在35~40 kDa 之間，等電點為 3.7[32-33]。多樣過氧化物酶首次在白腐真菌 Pleurotus eryngii[34]中報道。隨后，越來越多的多樣過氧化物酶在其他的擔(dān)子菌中被發(fā)現(xiàn)，Bjerkanderafumosa[35]和 Pleurotus pulmonarius[36]均報道具有產(chǎn)生多樣過氧化物酶的能力。多樣過氧化物酶同時具有木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）的催化活性，，能夠氧化 Mn2+，形成 Mn3+，催化藜蘆醇、染料和酚型與非酚型的芳香化合物[24]。多樣過氧化物酶的催化機制是結(jié)合 LiP 與 MnP 的催化電子傳遞循環(huán)機制[37]。但是這種酶的催化機制不同于典型的錳過氧化物酶，在催化的過程中，多樣過氧化物酶是不依賴 Mn2+，氧化結(jié)構(gòu)簡單的胺類物質(zhì)和酚型單體物質(zhì)[34]。在木質(zhì)素降解的過氧化物酶中，多樣過氧化物酶由于其催化的多樣性，包括多樣過氧化物酶也不同于其他過氧化物酶，它能直接氧化底物，因此在工業(yè)生物技術(shù)上的應(yīng)用具有很大的吸引力。但是多樣過
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S38;S182

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本文編號：2530680