【摘要】：嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophilus)(致病桿菌)是一種在病原線蟲腸道內能與小卷蛾斯氏線蟲互利共生的革蘭氏陰性菌,因其能產生殺蟲毒素、抑菌、抗癌等多種活性物質而倍受矚目。其具有初生型和次生型兩種型態(tài)。初生型致病桿菌(初生菌)極不穩(wěn)定,在傳代培養(yǎng)過程中容易轉變成次生型致病桿菌(次生菌)。它們不僅形態(tài)不同,多種生理特性也存在很大差異,因而限制了次生菌在農業(yè)上的應用。本論文基于致病桿菌型態(tài)變異的特性對初生菌和次生菌的某些生理特性和差異蛋白做了研究。主要研究內容如下:1、致病桿菌的篩選和鑒定。從線蟲幼蟲、線蟲成蟲和侵染后的大蠟螟中篩選初生菌,發(fā)現(xiàn)從侵染后的大蠟螟中篩選初生菌是種最優(yōu)的篩選分離方法,操作簡便、菌落純,效率高。而次生菌不僅可以從線蟲成蟲和侵染后的大蠟螟中篩選得到,而且還能在初生菌的多次傳代培養(yǎng)過程中獲得。形態(tài)學鑒定結果顯示初生菌平均長度4-5μm,呈桿狀,表面凹凸不平。16S rDNA鑒定結果表明目的菌株與X.nematophilusATCC19061的同源性達99%,表明成功篩選到目的菌株。2、致病桿菌的某些生理特性研究。研究制定了致病桿菌的生長曲線,研究了溫度和pH對致病桿菌生長速度的影響,同時還對菌株生長過程中培養(yǎng)液pH值的變化、菌株形態(tài)變化以及糖利用情況進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)溫度和p H對初生菌的生長影響較大。當溫度低于25℃或pH呈弱酸性時,其生長速度極慢。當溫度高于25℃和pH呈中性或弱堿性時,初生菌生長比次生菌均晚8-16小時進入對數生長期,在培養(yǎng)24 h時后初生菌逐漸向次生菌轉化,72 h時則已全部轉化為次生菌。它們在生長過程中只能分解葡萄糖產生有機酸,而不能利用乳糖和蔗糖。3、初生菌和次生菌的差異蛋白研究。利用iTRAQ技術共檢測到367種差異蛋白,其中除了其他學者研究過的Xcn蛋白和Xnph1蛋白外,初生菌蛋白質組中還發(fā)現(xiàn)了以下幾種特異性蛋白:與抗菌性相一致的Xcn蛋白和Xnph1蛋白、與致病桿菌附著點相關的鞭毛蛋白、菌毛適配器蛋白、菌毛粘附素和莢膜合成調節(jié)元件B蛋白;多個代謝通路中起重要作用的谷氨酸合成酶;具有腫瘤藥物耐藥性、且對正常細胞和惡性細胞產生的細胞毒化合物具有防護作用的多藥耐藥蛋白。
【圖文】：

1.1 嗜線蟲致病桿菌的概述嗜 線 蟲 致 病 桿 菌 （ Xenorhabdus nematophilus ） 和 嗜 線 蟲 發(fā) 光 桿 菌（Photorhabdus）是昆蟲病原線蟲共生菌的兩個屬，它們分別與斯氏線蟲屬（Steernema）和異小桿線蟲屬（Heterorhabditis）的線蟲共生[1]。Poinar[2]在 1966 年時便闡述了致病桿菌與病原線蟲之間互利共生的關系，致病桿菌存在于侵染期的昆蟲病原線蟲腸道內，形成病原線蟲-致病桿菌復合體，而侵染期線蟲利用本身能靈活有效地找到靶標昆蟲的特性，將攜帶的致病桿菌釋放到寄主昆蟲血腔內，隨后，被釋放的致病桿菌在血腔內大量繁殖并產生多種毒素蛋白以及具有殺蟲活性的物質，使得寄主昆蟲能在短期內敗血死亡[3-5]。在這期間致病桿菌能分解營養(yǎng)物質，為病原線蟲的生長繁殖提供營養(yǎng)，同時共生菌產生多種抗生素，抑制其它雜菌的污染，為線蟲的生長發(fā)育繁殖提供理想的環(huán)境6-10]。病原線蟲-致病桿菌的生活周期如圖 1-1。

保證病原線蟲的生長繁殖（如圖1-2b），與次生菌共同培育的病原線蟲不但不能長大，反而會在短期內死亡（如圖 1-2c）。王立霞等[81]分析并概括了初生菌和次生菌在病原線蟲培育方面存在的這種顯著差異的原因：初生菌在生長代謝過程中能產生多種酶類，能很好地分解培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，為線蟲的生長繁殖提供充足的營養(yǎng)；同時初生菌還能產生多種抑菌活性物質，能有效抑制其他的雜菌的生長，為病原線蟲的生長繁殖提供良好的環(huán)境；此外，初生菌能形成鞭毛，有助于初生菌占據病原線蟲腸道的特定空間，從而被線蟲攜帶。由此可見，有效控制致病桿菌的型態(tài)變異是實現(xiàn)病原線蟲高產的一條有效途徑。圖 1-2 線蟲幼蟲分別經初生菌和次生菌培育后的狀態(tài)Figure 1-2 The state of the nematode larvae after being cultured with the primary andsecondary bacteria respectively致病桿菌型態(tài)變異的發(fā)生既有菌體本身的機制，，也有環(huán)境因素的誘導，由于初生菌細胞本身的呼吸酶活性較低，在無氧或少氧環(huán)境中以及長期處于饑餓狀態(tài)下，都會誘導初生菌向次生菌轉化[85,86]。初生菌和次生菌之間的質粒是相同的，因此排除了致病桿菌產生型態(tài)變異是由于質粒缺失或者基因重排導致的[87]。2004 年王勤英[88]對致病桿菌 HB310 菌株的兩種型態(tài)（初生型和次生型）的蛋白質組分差異以及毒力相關基因進行了研究，結果表明初生菌與次生菌的胞內及胞外蛋白組分差別很大，且初生菌中具有的殺蟲活性蛋白組分在次生菌中根本不
【學位授予單位】：湖南工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S476.1

【參考文獻】

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本文編號：2530612