【摘要】：【目的】比較傳統(tǒng)顯微計(jì)數(shù)、單細(xì)胞分選和現(xiàn)代分子方法研究典型水稻土微生物組的細(xì)胞數(shù)量、物種組成及好氧甲烷氧化菌生理生態(tài)過(guò)程的技術(shù)特點(diǎn)�！痉椒ā酷槍�(duì)水稻土中可提取微生物細(xì)胞(土壤細(xì)胞)及其DNA(細(xì)胞DNA)、單細(xì)胞DNA、土壤微生物組總DNA(土壤DNA),利用傳統(tǒng)顯微計(jì)數(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法,研究水稻土好氧甲烷氧化過(guò)程中微生物數(shù)量的變化規(guī)律;通過(guò)高通量測(cè)序16S rRNA基因技術(shù),研究微生物物種組成的變化規(guī)律�！窘Y(jié)果】水稻土微生物組的傳統(tǒng)顯微計(jì)數(shù)結(jié)果顯著低于現(xiàn)代分子方法 qPCR,最高可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)�；贒API染色、CARD-FISH、細(xì)胞DNA及土壤DNA的qPCR定量結(jié)果分別為:(5.8 7.4)×10~7、(1.7 1.9)×10~7、(2.8 6.3)×10~8、(1.5 2.7)×10~(10) cells/g�；趒PCR的水稻土好氧甲烷氧化菌數(shù)量為1.1×10~7 cells/g,比傳統(tǒng)顯微計(jì)數(shù)方法高3個(gè)數(shù)量級(jí)。然而,當(dāng)水稻土氧化高濃度甲烷后,所有方法均發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌顯著增加,增幅分別為54倍(CARD-FISH)、388倍(細(xì)胞DNA)和45倍(土壤DNA)。在微生物分類(lèi)學(xué)門(mén)的水平,細(xì)胞DNA(25個(gè)門(mén))與土壤DNA(30個(gè)門(mén))結(jié)果基本一致,均能較好地反映水稻土微生物組的群落結(jié)構(gòu),而單細(xì)胞DNA盡管檢測(cè)到20個(gè)門(mén),但偏好性較大,95%以上均為Proteobacteria。在微生物分類(lèi)學(xué)屬的水平,土壤DNA、細(xì)胞DNA和單細(xì)胞DNA分析均表明背景土壤含有7個(gè)好氧甲烷氧化菌的pmo A基因型,但氧化高濃度甲烷后,γ-Proteobacteria的2個(gè)屬M(fèi)ethylobacter/Methylosarcina則成為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群�！窘Y(jié)論】土壤微生物的傳統(tǒng)顯微計(jì)數(shù)(DAPI和CARD-FISH)結(jié)果顯著低于qPCR技術(shù),相差1 3個(gè)數(shù)量級(jí)。qPCR定量土壤DNA和細(xì)胞DNA表明:水稻土可提取微生物細(xì)胞約占土壤微生物總量的2%左右,而好氧甲烷氧化菌的提取效率最高可達(dá)6%。細(xì)胞DNA在門(mén)水平能較好地反映水稻土微生物組成,但在屬水平和土壤DNA有著較大差異。Planctomycetes微生物門(mén)的細(xì)胞易被提取,Acidobacteria門(mén)的微生物則較難被提取,而單細(xì)胞分選技術(shù)則偏好Proteobacteria。盡管傳統(tǒng)方法和分子技術(shù)的分辨率明顯不同,但均能較好地表征水稻土甲烷氧化的微生物生理生態(tài)過(guò)程。未來(lái)土壤微生物組研究應(yīng)更加重視科學(xué)問(wèn)題本身對(duì)技術(shù)手段的內(nèi)在需求,最大限度發(fā)揮各種先進(jìn)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。
【圖文】：

5%，總有機(jī)碳15g/kg，總氮1.59g/kg，總磷1.23g/kg，pH7.4(水土比2.5)[13]。1.1.2實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線：如圖1所示，每個(gè)土壤可獲得4種不同的樣品：直接提取的土壤微生物細(xì)胞(土壤細(xì)胞)、從土壤細(xì)胞懸液進(jìn)一步提取的細(xì)胞DNA(細(xì)胞DNA)、從土壤細(xì)胞懸液經(jīng)單細(xì)胞分選及全基因組擴(kuò)增后獲得的DNA(單細(xì)胞DNA)和直接提取的土壤微生物總DNA(土壤DNA)。(1)針對(duì)水稻土微生物組的數(shù)量：采用DAPI染色和CARD-FISH雜交兩種顯微計(jì)數(shù)方法，分析土壤細(xì)胞數(shù)量；采用qPCR分子技術(shù)分析細(xì)胞DNA和土壤DNA中微生物基因數(shù)量。(2)針對(duì)水稻土微生圖1.實(shí)驗(yàn)整體思路和技術(shù)流程Figure1.Flowdiagramofthestudy.物的物種組成：采用高通量測(cè)序16SrRNA和pmoA基因的方法，分析土壤DNA、細(xì)胞DNA、單細(xì)胞DNA中的微生物組成。水稻土樣品則來(lái)自高濃度甲烷氧化前后，即零時(shí)刻的背景土壤(Day0)和氧化了600μmol甲烷的水稻土(Day-17)。最后比較傳統(tǒng)顯微計(jì)數(shù)、現(xiàn)代分子方法研究土壤微生物組的數(shù)量、組成及好氧甲烷氧化微生物生理生態(tài)過(guò)程的技術(shù)特點(diǎn)。1.1.3水稻土好氧甲烷氧化微生物過(guò)程：調(diào)整土壤含水量至最大持水量的60%(實(shí)際含水量33%)，在無(wú)菌封口袋中充分混勻后，28°C預(yù)培養(yǎng)4d，使土壤微生物充分活化。取8g作為0時(shí)刻樣品(Day0)， 20°C保存用于總DNA及土壤細(xì)胞的提齲其余土樣用于微宇宙培養(yǎng)。在120mL血清瓶中加入8g水稻土，，設(shè)置3個(gè)平行，用丁基橡膠塞密封后用鋁蓋封口，抽真空后，用注射器注入14.4mLCH4，36mLO2，并用N2補(bǔ)充至1個(gè)大氣壓，甲烷初始濃度約85.7g/m3，28°C避光培養(yǎng)。前10d每天監(jiān)測(cè)1次CH4濃度，10d后每3 4d監(jiān)測(cè)1次。待瓶?jī)?nèi)甲烷濃度降至7.14g/m3以下(第17天)終止實(shí)驗(yàn)，取出土壤保存于 20°C用于總DNA及土壤細(xì)胞的提齲培養(yǎng)

賈仲君等|微生物學(xué)報(bào),2017,57(6)907http://journals.im.ac.cn/actamicrocn圖2.水稻土氧化甲烷的動(dòng)力學(xué)過(guò)程(A)及土壤總微生物(B)與甲烷氧化菌(C)的數(shù)量變化Figure2.Consumptiondynamicsofmethanebypaddysoil(A),copynumberchangesof16SrRNA(B)andpmoAgenes(C)in1gwetweightsoil(wws)orincellsexractedfrom1gwetweightsoilbeforeandaftermethaneincubation.Errorbarsrepresentstandarddeviations(n=3),andcolumnswiththedifferentlettersaresignificantlydifferent(P<0.05)byone-wayANOVA.2.3基于DAPI染色和CARD-FISH雜交的土壤微生物組及甲烷氧化菌數(shù)量比較通過(guò)DAPI染色及CARD-FISH計(jì)數(shù)對(duì)土壤可提取微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)。如圖3-A所示，Day0樣本中總微生物細(xì)胞的DAPI計(jì)數(shù)為5.8×107cells/g，Day17樣本中略微增加至7.4×107cells/g。而CARD-FISH的計(jì)數(shù)結(jié)果分別為1.7×107cells/g(Day0)和1.9×107cells/g(Day17)(圖3-B)。DAPI染色的靈敏度更高，是CARD-FISH計(jì)數(shù)結(jié)果的3 4倍。利用TypeI和TypeII甲烷氧化菌的特異探針進(jìn)行CARD-FISH計(jì)數(shù)，結(jié)果表明高濃度甲烷氧化過(guò)程中，好氧甲烷氧化菌的數(shù)量顯著增加(圖3-C，D)。零時(shí)刻甲烷氧化菌數(shù)量較低，TypeI甲烷氧化菌約1.6×104cells/g，TypeII甲烷氧化菌約2.1×104cells/g；而高濃度甲烷培養(yǎng)后(Day17)，兩類(lèi)甲烷氧化菌數(shù)量均顯著增加(t-test，P<0.01)，TypeI甲烷氧化菌數(shù)量增加至1.7×106cells/g，增加100倍左右(圖3-C)。TypeII甲烷氧化菌增加到4.1×104cells/g，增加1倍左右(圖3-D)。Day0水稻土中甲烷氧化菌總量約3.7×104cells/g；Day17則增加至1.7×106cells/g，增幅約45倍。2.4基于高通量測(cè)序的土壤微生物組成分析在微生物分類(lèi)學(xué)門(mén)的水平，高通量測(cè)序
【作者單位】： 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;中國(guó)科學(xué)院微生物研究所微生物資源前期開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專(zhuān)項(xiàng)(B類(lèi))項(xiàng)目(XDB15040000) 國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(41401294)~~
【分類(lèi)號(hào)】：S154.3

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本文編號(hào)：2521664