【摘要】：以連作地黃根際土壤中的微生物為對象,篩選既能夠固氮又能夠耐受酚酸類物質(zhì)的細菌,并對其進行鑒定,為克服連作障礙的菌劑開發(fā)提供菌種資源。通過阿須貝無氮培養(yǎng)基平板涂布及分離純化試驗,最終獲得菌落形態(tài)特征鮮明的2株固氮菌:7號菌菌落濕潤、邊緣光滑、個體較大,橘黃色;12號菌菌落邊緣光滑、個體較小,乳白色。耐酚酸試驗結(jié)果顯示,在125、250 mg/L對羥基苯甲酸濃度下,7號菌液的D_(600 nm)分別是對照組的2.78、1.93倍,12號菌液的D_(600 nm)分別是對照組的3.66、4.66倍,因此,2株固氮菌能有效耐受一定濃度的對羥基苯甲酸。生理生化分析結(jié)果顯示,2株菌均具備水解淀粉、分解丙酮酸和產(chǎn)生吲哚的能力。16S rRNA測序及遺傳進化分析結(jié)果顯示,7號菌、12號菌分別與芽孢桿菌屬的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、假單胞菌屬的地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)聚到一起,相似度均高于99%。
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圖片說明： 測定不同試管中菌液的D600nm，評估菌株的耐受能力。1．416SrＲNA測序及分析參考文獻［10］中的做法，提取純化菌株的DNA。采用16SrＲNA通用引物27F:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，1492Ｒ:5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3'進行PCＲ擴增［11］。將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。利用Blast將所得16SrＲNA基因序列與EzBio-Cloud數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析。通過MEGA4．1軟件，應(yīng)用鄰近(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，確定所得菌株的分類地位。2結(jié)果與分析2．1固氮菌的分離與純化土壤樣品經(jīng)梯度稀釋并涂布于阿須貝無氮培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后，可看到有多個菌落產(chǎn)生。挑取平板上長勢良好的18個菌落進行克隆，進行多次劃線分離純化，進一步篩選得到2株菌落形態(tài)特征鮮明的固氮菌，編號是7號和12號。其中，7號菌形成濕潤、邊緣光滑、較大的橘黃色菌落;12號菌形成邊緣光滑、較小的乳白色菌落。2．22株固氮菌的酚酸耐受能力對羥基苯甲酸是酚酸類物質(zhì)的代表之一。為了檢測2株固氮菌的酚酸耐受能力，將2株菌分別接入加有不同濃度對羥基苯甲酸的阿須貝液體培養(yǎng)基中，4d后測定菌液D600nm。如圖1所示，在125、250mg/L對羥基苯甲酸濃度下，2株固氮菌生長速度均高于對照組(0mg/L)，7號菌液的D600nm分別是對照組的2．78、1．93倍，12號菌液的D600nm分別是對照組的3．66、4．66倍，且7號菌在125mg/L對羥基苯甲酸的濃度下生長情況最好，而12號菌在250mg/L對羥基苯甲酸的濃度下生長情況最好。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這2株菌在500mg/L酚酸培養(yǎng)基中的生長速度均低于對照組。這些結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，對羥基苯甲酸能夠促進這2株菌生長繁殖，，但是，過高濃度的對羥基苯甲酸會對這2株菌的生長繁殖造成一定程度的抑制作用。已
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圖片說明： 測定不同試管中菌液的D600nm，評估菌株的耐受能力。1．416SrＲNA測序及分析參考文獻［10］中的做法，提取純化菌株的DNA。采用16SrＲNA通用引物27F:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，1492Ｒ:5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3'進行PCＲ擴增［11］。將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。利用Blast將所得16SrＲNA基因序列與EzBio-Cloud數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析。通過MEGA4．1軟件，應(yīng)用鄰近(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，確定所得菌株的分類地位。2結(jié)果與分析2．1固氮菌的分離與純化土壤樣品經(jīng)梯度稀釋并涂布于阿須貝無氮培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后，可看到有多個菌落產(chǎn)生。挑取平板上長勢良好的18個菌落進行克隆，進行多次劃線分離純化，進一步篩選得到2株菌落形態(tài)特征鮮明的固氮菌，編號是7號和12號。其中，7號菌形成濕潤、邊緣光滑、較大的橘黃色菌落;12號菌形成邊緣光滑、較小的乳白色菌落。2．22株固氮菌的酚酸耐受能力對羥基苯甲酸是酚酸類物質(zhì)的代表之一。為了檢測2株固氮菌的酚酸耐受能力，將2株菌分別接入加有不同濃度對羥基苯甲酸的阿須貝液體培養(yǎng)基中，4d后測定菌液D600nm。如圖1所示，在125、250mg/L對羥基苯甲酸濃度下，2株固氮菌生長速度均高于對照組(0mg/L)，7號菌液的D600nm分別是對照組的2．78、1．93倍，12號菌液的D600nm分別是對照組的3．66、4．66倍，且7號菌在125mg/L對羥基苯甲酸的濃度下生長情況最好，而12號菌在250mg/L對羥基苯甲酸的濃度下生長情況最好。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這2株菌在500mg/L酚酸培養(yǎng)基中的生長速度均低于對照組。這些結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，對羥基苯甲酸能夠促進這2株菌生長繁殖，但是，過高濃度的對羥基苯甲酸會對這2株菌的生長繁殖造成一定程度的抑制作用。已
【作者單位】： 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;資源微生物與功能分子河南省高校重點實驗室培育基地;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(編號:21277041、21477035) 河南省高等學(xué)校重點科研項目(編號:15A180016)
【分類號】：S154.3


本文編號：2513335