【摘要】：玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae),以它的無(wú)性型孢子禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)而著名,它是一種植物病原菌,能夠引起大規(guī)模毀滅性的作物疾病,如小麥、大麥的赤霉病和玉米的穗腐病等。在感染赤霉病的小麥和感染穗腐病的玉米細(xì)胞內(nèi),赤霉病原菌可以產(chǎn)生兩種霉菌毒素,引起消化道反應(yīng)、肝損傷和家畜生殖缺陷,嚴(yán)重危害人類健康。在菌絲體滲透過(guò)程中,赤霉菌體會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞壁溶解酶,其中包括β-葡聚糖。人們認(rèn)為,β-葡聚糖酶作為一種細(xì)胞壁修飾酶能夠很好地分解β-葡聚糖和其他多糖組分,使其更容易降解,開(kāi)始得到人類的廣泛關(guān)注。內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶在纖維素的水解過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用,它能夠作用于纖維素鏈內(nèi)的β-1,4糖苷鍵,將長(zhǎng)鏈纖維素分子水解成更小分子量的葡萄糖聚合物。在原核生物和真核生物中,纖維素酶已經(jīng)形成一個(gè)大的家族體系并表現(xiàn)出不同的特性。在本實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶的基因序列(Genbank編號(hào)為ESU17701),根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,通過(guò)PTDS方法合成了適合于在甲醇畢赤酵母系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)的玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶(Gzegl AI)基因,并將載有目的基因的酵母表達(dá)載體YR1730,電擊轉(zhuǎn)化入甲醇型畢赤酵母GS115菌株體內(nèi)進(jìn)行分泌表達(dá),通過(guò)后期的活性鑒定、SDS-PAGE電泳等方法,獲得能夠表達(dá)玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶的陽(yáng)性酵母菌株。將獲得的陽(yáng)性畢赤酵母重組菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá),獲得重組β-1,4-葡聚糖酶,粗酶液經(jīng)鎳柱純化后,進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)特性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)等的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明:Gzegl AI的相對(duì)分子大小為27.17 k Da,蛋白定量為12.37μg/m L,等電點(diǎn)為7.75。酶的最適溫度是40o C,最適p H為4.5;當(dāng)把酶Gzegl AI置于4o C,24 h處理后,其在酸性p H下表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性,特別是在p H 4.0-6.5的活性高于80%;研究溫度穩(wěn)定性時(shí),把酶液在不同溫度下處理不同時(shí)間顯示,在50o C時(shí)處理半小時(shí)可保持初始酶活的30%,而當(dāng)溫度達(dá)到60oC時(shí)酶活急速下降,最終完全失活為零,所以此酶的熱穩(wěn)定性較差,并不耐高溫;本實(shí)驗(yàn)還探究了高低(1 m M和10 m M)兩種濃度的不同金屬離子對(duì)酶活性的影響,研究發(fā)現(xiàn)低濃度的Mn2+、高濃度的Mn2+和Cu2+對(duì)酶活有抑制作用,Cu2+抑制力較強(qiáng),而高濃度的Al3+卻極大程度地促進(jìn)了該酶活反應(yīng);選取羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、脫脂棉、濾紙和結(jié)晶纖維素(6%)等不同纖維素類物質(zhì)進(jìn)行底物特異性的反應(yīng)研究,結(jié)果顯示該酶對(duì)底物羧甲基纖維素鈉有較強(qiáng)的專一性,其Km值為73.92 g/L,Vm值為0.16 g/(L.min);同時(shí)也研究了兩種蛋白消化酶如胃蛋白酶(pepsin)和胰蛋白酶(trypsin)對(duì)Gzegl AI活性的影響,結(jié)果顯示胃蛋白酶對(duì)酶活性有一定程度的抑制作用,相反地,胰蛋白酶卻對(duì)酶促反應(yīng)無(wú)任何研究影響。根據(jù)SWISS-MODEL網(wǎng)站的PDB數(shù)據(jù)庫(kù)資源比對(duì)分析,選取4h7m.1.A(Th EG3)為模板進(jìn)行同源性建模,兩者相似度高達(dá)58.72%;同時(shí)發(fā)現(xiàn),此β-1,4-葡聚糖酶屬于糖基水解酶第12家族中,其三個(gè)催化殘基Asp120、Glu137和Glu221在進(jìn)化中是嚴(yán)格保守的。鑒于目前缺乏玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶的相關(guān)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)畢赤酵母分泌表達(dá)玉蜀黍赤霉菌的β-1,4-葡聚糖酶基因,研究該β-1,4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)與功能,不僅為闡述β-1,4-葡聚糖酶在玉蜀黍赤霉菌發(fā)育進(jìn)程及致病機(jī)理中所起的作用提供理論依據(jù),并且為玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶高效工程菌株的構(gòu)建和工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種潛在的應(yīng)用選擇。
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【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S432.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2443081