【摘要】：堿性神經(jīng)酰胺酶和中性鞘磷脂酶是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)鞘脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶類。鞘磷脂酶能水解神經(jīng)鞘磷脂生成神經(jīng)酰胺和磷酸膽堿,神經(jīng)酰胺酶水解神經(jīng)酰胺生成游離脂肪酸和神經(jīng)鞘氨醇,這些鞘脂質(zhì)在生物體內(nèi)具有非常重要的生理作用。前期研究發(fā)現(xiàn):堿性神經(jīng)酰胺酶通過調(diào)控神經(jīng)酰胺水平在果蠅的發(fā)育、生殖和存活中發(fā)揮重要的生理作用。在此基礎(chǔ)上,我們提出神經(jīng)酰胺酶和鞘磷脂酶能夠調(diào)控二化螟體內(nèi)神經(jīng)酰胺水平,在二化螟的發(fā)育和存活過程中發(fā)揮重要作用的設(shè)想。本研究以重要農(nóng)業(yè)害蟲二化螟為研究對(duì)象,對(duì)二化螟的堿性神經(jīng)酰胺酶和中性鞘磷脂酶的生化特征進(jìn)行了研究,并初步探索了它們?cè)诙w內(nèi)的生理功能。本研究的最主要結(jié)果如下:1.由二化螟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)獲得其堿性神經(jīng)酰胺酶saCER和中性鞘磷脂酶snSMase的基因片段序列,運(yùn)用RT-PCR的方法克隆得到這兩個(gè)基因的編碼區(qū)cDNA序列。saCER開放閱讀框(ORF)大小為807bp,可編碼269個(gè)氨基酸;snSMase開放閱讀框大小為1250bp,編碼409個(gè)氨基酸。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)saCER蛋白序列與果蠅堿性神經(jīng)酰胺酶(DaCER)具有56%的序列一致性,與人類、小鼠及酵母的堿性神經(jīng)酰胺酶蛋白序列也有較高的同源性。snSMase蛋白序列與家蠶、蝴蝶、螞蟻、赤擬谷盜等的中性鞘磷脂酶的蛋白序列分別具有70%、67%、42%和40%的同源性。此外,saCER和snSMase在sf9細(xì)胞中成功表達(dá),Western blot檢測(cè)這兩個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物分子量分別為38kD和44kD。2.對(duì)saCER的生化特征的研究,得到以下結(jié)果:pSORTII等程序?qū)aCER蛋白結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)域以及亞細(xì)胞定位的分析結(jié)果顯示,saCER存在7個(gè)潛在的跨膜區(qū)域,說明saCER可能是多跨膜區(qū)域神經(jīng)酰胺酶超家族中的一員;saCER主要定位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。在sf9細(xì)胞中大量表達(dá)的saCER蛋白,在37℃C下,以D-e-C24:1 ceramide為底物,能夠明顯地表現(xiàn)出神經(jīng)酰胺酶的活性,說明saCER編碼的蛋白具有神經(jīng)酰胺酶的活性。saCER蛋白產(chǎn)物在pH 5.0到pH 10.0的范圍內(nèi)均具有神經(jīng)酰胺酶的活性,但在pH9.0時(shí)活性最高,由此可說明saCER所編碼的蛋白確實(shí)是堿性神經(jīng)酰胺酶。3.對(duì)snSMase的生化特征的研究,得到以下結(jié)果:pSORTII等程序?qū)nSMase蛋白結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)域、亞細(xì)胞定位的分析結(jié)果顯示,snSMase只存在1個(gè)潛在的跨膜區(qū)域,主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體上。我們推測(cè)snSMase也是一個(gè)跨膜蛋白。在sf9細(xì)胞中大量表達(dá)的snSMase蛋白,在37℃下,以C6-NBD-sphingomyelin為底物時(shí),snSMase表現(xiàn)出來的鞘磷脂酶的活性是對(duì)照的10倍左右;在不同的pH條件下對(duì)snSMase的酶活力進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),它能夠適應(yīng)的pH范圍很狹窄,僅在pH7.0左右表現(xiàn)出了較高的活性,說明snSMase確實(shí)是一種中性鞘磷脂酶。4.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)saCER和snSMase生理功能的研究,得到以下結(jié)果:saCER和snSMase基因在二化螟不同發(fā)育階段及不同部位都有表達(dá)。在所有的發(fā)育階段中,saCER和snSMase均在蛹期的表達(dá)量最高,且隨著二化螟從幼蟲發(fā)育到成蟲的發(fā)育進(jìn)展,5aCER和snSMase mRNA的表達(dá)水平也不斷升高,說明saCER和snSMase在二化螟的完全變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。在二化螟的不同的組織器官中,saCER在胸部和足部有最高的表達(dá)量,而snSMase在胸部和卵巢中的表達(dá)量顯著高于其它組織器官,說明saCER可能參與二化螟蛻皮激素水平的調(diào)控并且在肌肉系統(tǒng)中發(fā)揮重要的生理作用,而snSMase則可能主要在二化螟蛻皮激素水平的調(diào)控及生殖過程中發(fā)揮生理作用。綜上所述,本研究克隆得到的saCER和snSMase基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)后分別具有堿性神經(jīng)酰胺酶和中性鞘磷脂酶的活性并可能在二化螟的鞘脂質(zhì)代謝、發(fā)育及生殖過程中發(fā)揮重要的作用,具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S433.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 朱捷;楊成君;王軍;;熒光定量PCR技術(shù)及其在科研中的應(yīng)用[J];生物技術(shù)通報(bào);2009年02期

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1 周瀛;昆蟲鞘脂質(zhì)代謝途徑相關(guān)酶的生化特征和功能[D];浙江大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：2438591